DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳.docxVIP

1。变性：二、聚丙烯酰胺凝胶电泳　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离.　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.　　聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.丙烯酰胺(%)??有效分离范围(bp)??溴酚兰*??二甲苯青*3.5??100～2000??100??4605.0??80～500??65??2608.0??60～400??45??16012.0??40～200??30??7015.0??25～150??15??6020.0??10～100??12??45　　*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2．准备工作：1。必要时可用KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片2．用温热的去污剂溶液洗涤玻璃片和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水，应拿取玻璃板的边缘部分或戴手套操作，以免手上的油脂残留再玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板，并将其至于一边晾干。3．安装玻璃与间隔片：将较大的（不带拗口）玻璃板平放在试验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行至于边缘放妥：用凡士林轻涂以帮组与间隔片在后面操作中保持原位；将那板在间隔片上放稳。　　2.30%丙烯酰胺　　丙烯酰胺，29克　　N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克　　H2O，加至100ml　　装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.　　3.10%过硫酸铵　　过硫酰铵，1克　　加水至，10ml　　4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.4.1XTBE电泳缓冲液：（89mmol/lTris-硼酸，2mmol/lEDTA(ph8.0),TBE用5×储备液稀释即可，缓冲液PH8.3　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)35ul(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.　　1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.　　2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.　　3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.将上述液体加入TEMED35ul后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.最后加入1mlH2O覆盖层，室温静置30min左右至分离胶凝聚，倾去覆盖层，并用吸水纸吸净。5.将上述液体混匀后加入电泳槽中立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10°角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合1h后（聚合完全后，用1×TBE浸润的纸巾保绕梳子和凝胶的顶部，然后用saran wrap膜密封整块凝胶，4度保存，直至使用），将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入1XTBE 缓冲液　　7. .当准备好电泳时，在梳子周围及顶部喷些1×TBE缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子，立即用注射器吸取1×TBE缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.用剃刀除去凝胶底部的密封条　　8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后(．制备样品：取中号EP管，每管加入10ul,4*loading buffer,加样20－30ul（视样品浓度而定）,混匀后，煮沸5min,离心)，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.（加样孔中的气泡要用注射器针头除去）　　9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.电泳80V×1hr,然后调置100V*4hr　　10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.　　11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.　　12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.银染1.??．染色液：溴化乙定溶液（贮存液0.5ug/ml）（TAE配置：EB为10mg/ml，取1ul,1*10(-3)ml*10mg/ml=10(-2)mg,10(-2)/x=0.5*10(-3)----x=20ml）,亚甲基蓝贮存液（0.001%-0.0025%,TAE配置）2.??步骤：1。将凝胶及其附