实验动物现代新技术（二）转基因动物技术.ppt

转基因动物技术 转基因动物培育的基本原理 根据DNA异源重组的性质，借助分子生物学技术和胚胎工程技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源目的基因的转基因动物。 一、基因显微注射法培育转基因小鼠的程序 母鼠注射PMSG 48h 结扎公鼠 注射HCG ↓ 15d 与正常公鼠交配 与正常母鼠交配 ↓ ↓ 采集受精卵 假孕母鼠 ↑显微注射 ↓21d 目的基因(DNA) Founder转基因小鼠 ↓杂交、筛选 纯合转基因小鼠 1．目的基因的制备与纯化 目的基因可以来源于： ①通过限制性内切酶预先分离的某一基因。 ②逆转录法得到的cDNA。 ③人工合成的DNA片段。 ④聚合酶链式反应(PCR)扩增的特定基因片段。 目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组因子，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒 DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。 目的基因的克隆也可以通过PCR来实现。 2．卵供体母鼠和假孕母鼠的准备 定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎公鼠。 3．超排卵与取卵 选择4～6周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后，隔42～48h再注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，注射HCG后10～13h剖腹取卵，用培养液保存，置C02培养箱备用。 4．基因显微注射 用专门的持卵管和注射针，在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因(DNA)注射到受精卵的雄性原核内(雄性原核较雌性原核大)。 5．受精卵移植 转基因受精卵在单细胞至桑椹胚阶段移植到受孕后0．5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2．5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植20-30个转基因卵为宜。 6．目的基因限达整合的鉴定和检测 从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、Southern blot(DNA印迹)、FISH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过Northern blot(RNA印迹)和Western blot(蛋白质印迹)等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠(首建鼠)。 7．建系 将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50％左右时，即基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传稳定的转基因小鼠近交系。 二、逆转录病毒感染培育转基因小鼠 构建逆转录病毒载体 交配后48h取8细胞胚胎 (外源目的基因克隆到载体中) ↓ 逆转录病毒载体转染包装细胞→胚胎转染外源目的基因 建系获得转基因小鼠←产仔筛选←胚胎移植假孕母鼠子宫 三、胚胎干细胞介导法培育转基因小鼠 培育程序 分离培育ES细胞→ES细胞基因操作→获取囊胚 →ES细胞显微注射到囊胚 →胚胎移植 →产仔、筛送、建系 外源目的基因整合方式 ● 基因随机插入→转基因小鼠 ● 基因剔除（内源基因定点突变） →基因剔除小鼠 ● 基因替换（内源基因定向重组） →基因替换小鼠 转基因动物的应用 研究基因的结构和功能及其表达与调控。 建立人类疾病动物模型。 研究人类疾病基因治疗。 研制生物反应器，生产天然活性药物蛋白。主要通过乳腺生产（动物乳腺生物反应器），少数通过肾脏和膀胱。1999年，只有三种产品进入临床实验；到2004年，已经有40多种进入临床实验或即将进入市场。 美国红十字会预测：到2010年，转基因动物生产的商品将达到350 亿美元的销售额，生产的药物将占整个基因工程药物的90%以上。 扩大移植供体来源。 改良动物品种。 Gene Knockout by Homologous RecombinationUsing an “O” or “I