核酸分子杂交-.ppt

hybridization  single strand to double strand 影响核酸分子杂交的因素： 探针浓度、长度、复杂性 离子强度 温度与变性剂（甲酰胺） 添加剂 杂交条件的严谨性 杂交温度： 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%） M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性 prehybridization 概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。 第二节 核酸探针 probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。 核酸探针标记方法 放射性同位素的选择： 32P 优点：放射比活度高 缺点：半衰期短（14.3D）、散射严重 35S 优点：分辨率较高，半衰期长（87.4D）放射比活度高 缺点：放射比活度只有32P的1/6 3H 优点：半衰期长（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位 缺点：活性低 非放射性标记核酸探针 生物素化核苷酸 标记方法： （2）化学标记法：光敏生物素标记法，强光10-20分钟 光敏生物素的结构 2．地高辛 ( digoxigenin ) 标记法 dig-dUTP的结构 第三节 核酸分子杂交技术 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 一、膜上印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。 1．固相支持物的选择 Membrane types Nylon membrane Charged nylon Durable Nylon modified with amine groups Uncharged nylon Durable Nitrocellulose membrane Fragile Used primarily for protein transfers Capillary Blotting (upward) no special equipment required! Vacuum blotting Prehyb/Hybridization/Rinses 核 酸 杂 交 分 类 表 1975年 E.Southern Southern DNA 印迹转移技术 DNA片段1kb，1小时 DNA片段15kb，18小时 30~60分钟 more efficient and quantitative than capillary must apply vacuum evenly and not too strongly Electrophoretic blotting 不宜用硝酸纤维素膜 一般2~3小时，最多6 ~8小时 especially good for small fragments resolved by PAGE 3．印迹类型 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交 Paper Towels Southern Blotting 1 tissue SDS ProtK Phenol Chloro ETOH ppt Spin 核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。 探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。 检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。 核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、高度的特异性 第一节 核酸分子杂交的基本原理 一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization） 变性、复性、杂交示意图 denaturation renaturation probe hybridization 单链核酸的起始浓度 核酸链长度（分子量）