蛋白质组学-生物质谱及应用.ppt

? 胶内差示荧光电泳（DIGE）技术的建立 DIGE：血清去高丰度后差异图谱 蛋白质组学研究中的方法评价与创新 ? 高丰度蛋白对低丰度蛋白检测的抑制效应 ——高丰度去除、低丰度富集技术的评价及在血浆蛋白质组学研究中的应用 ? 磷酸化修饰蛋白检测效率低、数据确认困难 ——磁性纳米材料靶上特异富集磷酸肽的方法 ——固相金属亲和柱（IMAC）的制备 ——全程自动化的磷酸化蛋白质研究体系的建立及其应用 ? 缺少自主知识产权的蛋白质组学研究新技术新方法 ——化学修饰辅助的蛋白质组研究新技术 ——磺化修饰辅助的蛋白质N-端序列快速测定法的建立与应用 ——建立和完善稀土元素金属螯合标记定量蛋白质组新方法 当前蛋白质组学研究的技术难点 不同免疫亲合处理技术用于人血浆蛋白质组研究，白蛋白免疫共沉淀辅助验证蛋白质相互作用 RPLC-ESI-Ion Trap MSMS SepproTM MIXED12 人血浆 Shotgun+SCX分离 数据分析比较 实验1：两种不同的免疫亲和预处理去除高丰度蛋白质 人血浆 SDS+酶解 实验2：白蛋白免疫共沉淀检测相互作用蛋白质 高丰度去除、低丰度富集技术的评价及在血浆蛋白质组学研究中的应用 GO分析 2个流出组分 结合组分中有更多的低分子量蛋白质 2个结合组分 Ion Trap ESI-MS 1D-nLC/MS/MS 白蛋白免疫共沉淀结果 鉴定了40种与白蛋白相互作用的蛋白质，其中24种在免疫亲和结合组分中存在，证明去除的高丰度蛋白与其他蛋白质间相互作用，导致结合组分中含有部分其他蛋白。 通过制作“磁性靶”，将二氧化钛纳米磁微粒固定在点样圈内，起到富集磷酸肽的作用，使2DE胶上酶解的磷酸化肽段的检出率大大提高。 磁性二氧化钛（ Fe3O4/TiO2 ）纳米微粒富集磷酸肽方法 毛细管固相金属亲和色谱－反相液相色谱－串联质谱（IMAC-RPHPLC-MSMS）磷酸化蛋白质自动化分析平台 将自行发明一种毛细管色谱柱筛板制作和装填的新方法，应用于在线的2DLC-ESI-MSMS分析中，形成自动化的磷酸化蛋白质研究技术平台 reduction trypsin N-端肽Neg-MS信号增强，易于识别 H2N-Protein-COOH (guanidination) （sulfonation） HSO3-Protein-COOH HSO3-Peptide + Peptide 侧链氨基修饰 N-端磺化修饰 磺化修饰辅助的蛋白质N端测序方法 转换至 Pos-MSMS模式y离子明显增加 磺化肌红蛋白及其N-端肽段序列分析 ? 磺化反应只发生在N-端； ? 负离子模式应用DHB 做基质N-端肽信号明显增强； ? 二级质谱 y 离子系列离子明显增加 (*GLSDGEWQQVLNVWGK,1-16) 定量蛋白质组学研究面临的问题： ——商品化的定量试剂盒价格昂贵 ——多数以稳定同位素为质量标签 元素标记亲和标签（ECAT, Element-coded affinity tags）选择化学性质很相近的稀土元素为质量标签，为定量蛋白质组学研究开辟了一个新思路。 可作为元素标签的稀土元素中的单同位素元素 稀土元素金属螯合标记定量蛋白质组新方法 ——DTPA螯合稀土金属标签蛋白质组定量新方法 设计原理及技术路线 待测样本 对照样本 酶切 合并样本 1220 1300 1380 1460 m/z 200 400 600 800 m/z 0 100 LRRASLG | Tb tag Tb tag MS MS/MS DTPAA偶合 YCl3 TbCl3 色谱分离 应用廉价易得的“二乙三胺五乙酸”（DTPA）螯合稀土金属元素标签，结合在线或离线的RPLC-ESI-MSMS分析，获得定量信息。 DTPA螯合稀土金属标签定量新方法在蛋白质组学研究中的应用考察 具有自主创新知识产权的定量蛋白质组研究新方法 技术路线： MALDI-TOF-MS SARS病毒蛋白 SDSGel Slicing Trypsin ESI-QTOF-MS SARS冠状病毒蛋白质组研究 实验路线： SDS/串联质谱鉴定 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 S M N Vero Vero SARS SARS Marker 94,000 67,000 43,000 30,000 20,100 14,400 VSN02 VEN02 A