流式原理及应用A.ppt

基本原理 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路 光源 滤片 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计：计算机 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 μm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELL 光 路 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列 散射光信号—前向散射光(FS) FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小 散射光信号 – 侧向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 光路-荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号 荧光染料的特性 常用荧光染料的特性 常用荧光染料(488nm,633nm激发) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Phycoerythrin (PE) Allophycocyanin (APC) Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures) 流式细胞仪FLOW CYTOMETER 原理及应用A EPICS XL 流式细胞分析仪 　　流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、 分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计 算机技术等学科高度发展、综合的结晶。 FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进 入了细胞和分子水平的研究, 流式细胞术 流式细胞仪与显微镜 FLOW MICROSCOPE 光源 激光 自然光、灯光、氙(汞)灯 对象 细胞、生物粒子 细胞、生物粒子 承载工具 载(盖)玻片 鞘液及流动室 检测信号 光学信号 形态及染色 放大方式 PMT，放大电路 目镜X物镜 统计 人工，200 计算机，5000 结果 简单，单参数 多参数，综合分析 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 光 路 光源 检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片 检测信号 FALS Sensor Laser 前向散射光 前向散射光 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光 侧向散射光 90 Degree Scatter 0 200 400 600 800 1000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Light Scatter Gating Scale 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620