细胞工程研究生052.ppt

细胞培养： 使用单个细胞悬液. 组织培养： 使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）. 器官培养： 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫. 培养细胞的生存环境 1.环境无毒和无菌； 2.适宜的温度；人: 35－37℃。 3.气体环境和氢离子浓度；95％空气+5%CO2；pH7.2-7.4 4.渗透压；一般 260－320mOsm/kg 5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等 贴壁细胞原代培养 一般持续1－4周。 分离沉淀细胞，按实验要求，制成需要的细胞悬液，接种培养，1—2天换液一次，细胞贴壁生长。 完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位／毫升 取材 1)理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养。 2）幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、肿瘤组织较正常组织易培养 3）组织取材先切成1cm3的小块，可置于培养液中4度保存，不易超过24小时。 4）取材时避免污染及化学物质的损伤。 EDTA法 二乙烯四乙酸二钠，非酶性消化物 用于消化分离传代细胞，能螯合钙离子，镁离子， EDTA工作液用不含钙离子和镁离子的BSS配制成0.02%的浓度 通常和0.25％的胰蛋白酶1：1合用 细胞悬液的分离方法 材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可以采用离心法分离细胞。 一般多用500－1000rmp，5－10分钟。 双盖玻片悬滴培养法 方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。 培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。 优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。 2.培养瓶原代培养 器材：培养瓶 材料：组织块或单层细胞 方法：单层细胞用消化培养法，将组织消化成为细胞悬液后培养 组织块以间距0.5cm均匀摆置在瓶壁上，翻转瓶，注入适宜培养液，37℃恒温2—4小时，待贴附后，再翻转平放，静置培养。 培养瓶传代培养 提高克隆形成率的措施 培养基：最好使用适应性培养基，即不含细胞而被细胞生活过的培养基。 其它 血清：以胎牛血清最好，应先做克隆形成率试验。 激素：1－10国际单位/ml营养液的胰岛素能促进细胞克隆的形成。 CO2：多用5％的浓度。 底物特殊处理：可用多聚右旋赖氨酸处理培养瓶皿底物或5ug/ml的纤维连结素处理。 适应性底物：初代培养细胞易贴于胶原层或血浆纤维蛋白层底物上。或用2％的琼脂层作为底物。 技术方法 1）有限稀释法：制备细胞悬液，密度为10个细胞/ml。 2）毛细管法 3）将细胞接种在不同的接种底物上。 4）克隆形成率与细胞接种的数量有关。 接种底物 多孔塑料板克隆细胞法 1）将均匀的10个/ml的细胞悬液向多孔板的孔内加入0.15ml。 2）置于CO2温箱内培养，注意保持湿度95％。 3）适时、适量换液。 4）当孔内细胞增到500－600个时，可以进行分离培养。 微生物污染途径 a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。 b.器材：培养器皿、器械，CO2培养箱。 c.操作：无菌观念不强。 d.血清：质量不好、检查不严。 e.组织样本：避免用碘消毒。 污染对细胞的影响 培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回 1）轻度时即使去除污染物，可能恢复 2）重度会引起细胞增殖停止，脱壁 3）不同污染物对细胞的影响有差别 支原体、病毒→缓慢，长期； 霉菌，细菌→短时间内杀灭细胞， 化学物质影响不定 污染的检测 真菌污染：肉眼可见，易发现，有白色或浅黄色污染物 细菌污染：培养物颜色变黄，出现混浊 以上两者都可通过显微镜进一步检测 支原体污染：利用相差油镜，荧光染色法，电镜，DNA分子杂交或支原体培养法以及PCR分子检测 微生物防治 ①多数污染无法挽救，弃之 ②细胞培养的关键在于无菌操作 ③利用抗生素，加温处理，动物体内接种等处理污染。 另外：防止细胞交叉污染 2.4动物组织培养的进展 2.41无血清培养技术 2.42大规模细胞培养技术 2.43特种细胞组织培养 2.44种质资源的长期保存 无血清培养液 ①血清具有很多功能，但具有一定的干扰性 ②根据不同细胞系和细胞株，无血清培养液需要添加不同成分，如：激素，生长因子，结合蛋白质类，贴壁和铺展因子，低分子量营养因子等 ③基础培养液多