酶工程实验指导2011.doc

《酶工程实验》指导 实验一 α—淀粉酶的活力测定 一、目的与原理 掌握α—淀粉酶活力的单位定义、α—淀粉酶活力的测定原理，掌握测定的方法。 α—淀粉酶的测定方法很多，活力单位的定义差别很大。现介绍D60℃消色法。 D60ˊ60℃消色法：这是我国常用的α—淀粉酶的测定方法。在pH值6.0，60℃条件下，每小时催化1g可溶性淀粉成为糊精的酶量为1个酶活力单位。 α—淀粉酶能将淀粉分子中α-1、4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应颜色逐渐变淡，呈红棕色直至最后为碘液本身颜色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过颜色消失速度测定α—淀粉酶活力。 二、试剂： （1）碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，加水溶解定容至500mL。 （2）标准碘溶液：称碘原液15mL，加碘化钾8g，定容至500mL。 （3）比色稀碘液;取碘原液2mL，加碘化钾20g，定容至500mL。 （4）2%可溶性淀粉：称取绝干溶性淀粉2g，先以少许蒸馏水混合均匀，再徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2min，冷却后定容至100mL（此溶液当天配制使用）。 （5）pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g，柠檬酸（C6H9O7.H2O）8.07g，加蒸馏水定容至1000mL。 （6）标准糊精液：称取分析纯糊精0.3g，用少许蒸馏水混匀后倾入400mL水中，冷却后定容至500mL，加几滴甲苯防腐，冰箱保存。 三、操作： （1）吸取1 mL标准糊精液，置于盛有3 mL标准碘液的试管中，作为比较颜色的标准管，（或吸取2mL置于白瓷板的空穴内，作为比色标准）。 （2）在25×200mm试管中，加入2%可溶性淀粉液20mL，加缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL酶液，立即计时并充分混匀，定时取出1mL反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内（或取出0.5 mL于预先盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内），当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙色，与标准色相同时，即为反应终点，记录时间。 四、计算： α—淀粉酶活力（D）=（60/t×20×2%×n）/0.5(单位/mL) 式中t——反应时间 n——酶液稀释倍数 0.5——使用的酶液量（mL） 实验二 葡萄糖氧化酶的活力测定 一、实验目的与原理 掌握葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶经微生物发酵和纯化绿色生物食品剂，无毒无副作用。能够除去食品中溶解氧，起到保鲜、护色、防褐变、保护维生素C、延长食品保质期的作用。高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂，50%丙酮、60%甲醇能使其沉淀。一般制品中均含有氧化氢酶，酶的最大光吸收波长为377～455ｎｍ。在紫外光下无荧光，但在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。固体葡萄糖氧化酶制剂在0℃下保存至少稳定2年，在-15℃下则可稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的H值范围为3～4，最适H值为5，如果没有葡萄糖等保护剂的存在，H值大于8或小于3葡萄糖氧化酶将迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度为30～60℃，该酶不受乙二胺四乙酸、氰化钾及氟化钠抑制，但受氯化汞、氯化银、对氯汞苯甲酸和苯肼抑制。 葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，简称GOD)是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢葡萄糖酸葡萄糖酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖酸 1 1.00 8.50 0.5 2 1.25 8.25 0.5 3 1.67 7.83 0.5 4 2.50 7.00 0.5 5 5.00 4.50 0.5 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5 min时立即加2.0mL 25% H2SO4终止反应，充分混匀。用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S] = v = 式中 [S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2的体积（mL）； 10：反应的总体积（mL）； v：反应速度（mmol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4的体积（mL）。 以1/ v对1/ [S]作图求出Km。 实验四 卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究 原理 果蔬中过氧化物酶具有很高的热稳定性。对果蔬进行热烫处理时，常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准。在热烫之后，如果果蔬中过氧化物酶完全（或95%以上）破坏，那么其他存在于果蔬中的酶一般认为都已失活。 许多实验证明果蔬中过氧化物酶由