11 生理学方法.ppt

第11章　生理学方法 11.1导言 　本章着重研究用生理学方法来测定纯培养和环境样品中的微生物活性． 对纯培养样品，能测出在给定条件下微生物所能达到的最高活性水平 对环境样品，可以提供环境中实际的或潜在的微生物活性的相对水平． 　 对于未受干扰的环境，测定微生物的活性能反映原环境中微生物的基本活性水平，它受环境中营养物质的状况、生物、化学及物理参数等因素的影响。通过对微生物活性的测定可以建立环境中基本微生物群落对不同刺激的反应． 　这些刺激包括自然可变参数：如湿度等 　　　　　　　人为可变影响：如施肥、耕作活动等 从生态学意义上来说，通过对未受干扰环境中微生物的活性测定可以确定在此生态系统的营养循环中微生物所做的贡献。 　 　 对于受扰环境，可以通过测定微生物的活性来衡量环境的“健康”状况，并可以用来估计干扰对微生物群落的影响，例如，可用微生物活性来估计如种植、伐木、采矿等实践活动对特定土壤质量的影响。 此外，也是估计扰动场所修复过程的重要指示物．实例有内源生物修复或自然衰减． 　 11.2纯培养微生物活性测定 表示呼吸的综合方程来描述纯培养生长 　末端电子受体ＴＥＡ是氧（对好氧条件）或者是几种选择性的末端电子受体中的一种（对于厌氧条件） 基质＋氮＋末端电子受体　　　细胞质量＋ＣＯ２＋水 11.2.1.1 化能异养基质 异养活性基质是以碳物质为基础的。 测定方法取决于基质分子的化学性质和组分形式 硫氧化 方法一：向样品中加入元素硫并测定培养时产生的硫酸盐，过程复杂。通过在酸性条件下添加BaCl2形成沉淀物来测定SO42-含量，再以专门测定金属元素的原子吸收仪来测定溶液中的Ba2＋含量，然而AA测定某些特定的金属时，它很难区分溶液中给定金属的不同存在状态。在这里，硫氧化增加的SO42-通过测量与SO42-结合而减少的Ba2＋的量来测定。 方法二：测定硫化物存在时吸收的CO2。 11.2.2 末端电子受体 各种可被微生物有效利用，活性水平可反映在TEA消减和还原性TEA的产生上。 氧吸收：氧是限制性营养，它较好地用于测定生长和活性 选择末端电子受体：不如氧那样普遍，比较复杂耗时 氧电极：不是绝对氧量，而是对于氧饱和溶液的相对氧量 比色法：溶氧滴定比色 选择末端电子受体 例如：反硝化过程中，NO3-作为末端电子受体被还原依次生成NO2，NO，N2O和N2。一种常用的测定反硝化作用的方法是用乙烯阻断N2O还原生成N2，积累N2O，色谱测定。 纯培养中细胞量增加的计数方法有两种：平板 计数和显微镜计数。已经讲过 另外两种方法： 浑浊度 蛋白质含量 不适用于环境样品，测定纯培养基中细胞量增长具有简单，快捷，可重复性等优点 浑浊度 测定细菌悬浮液的混浊度，一般用比色法或分光光度法。 在低细菌密度情况下，细菌量与光分散量呈线性关系， 高密度情况下，两者非线性 所以对每一种有机物浊度的测定，必须建立一个标准曲线。 蛋白质含量 有多种方法，用得最多的分析方法是 Fulin Cocmassie blue Bichinchoninic 都是蛋白质与分析试剂发生显色反应 选择何种方法取决于样品的组分的种类和潜在干扰 分析前要裂解细胞，使蛋白质释放出来。 11.2.4 CO2释放 已经用于测定好氧矿化作用。也适用于测定厌氧条件下释放的CO2 CO2吸收 碱性吸收剂可以用来吸收矿化过程产生的CO2。再用滴定计，比重计或热电导计来检测 14CO2吸收 利用14C标记的基质，可以灵敏且专一地测定释放的14CO2，释放CO2的与加入的基质相互对应 用于评估有机污染物生物降解的可行性和降解率 * * 本章的目的就是研究纯培养和环境样品中微生物活性测定的不同方法． 纯培养微生物活性测定相对直接，但是环境群落包含了微生物多样性和生理类型多样性，因此弄清楚不同的测定方法以及每种方法的特点很重要． 纯培养中活性测定方法：基质消失，末端电子受体ＴＥＡ的利用，细胞量增加和ＣＯ２释放． 环境样品中活性测定方法：４种广泛的类型，碳呼吸，放射性标记物掺入细胞大分子，腺苷能荷ＡＥＣ，酶活性分析 基质 消减 ＴＥＡ利用 生物量产出 CO2 释放 11.2.1 基质消减　　　　　　　 例1：在单一基质系统中，芳香族化合物，可以通过UV分光光度计测出。 左图是苯甲酸酯的吸收光谱 例2，荧光机可以用来检测荧光分子，比如单一组分系统中多环芳烃。 荧光计比紫外分光光度仪灵敏度更高。 11.2.1 基质消减　　　　　　　 对多组分系统，或组分复杂的样品，在检测目标化合物前需要分离或层析。色谱层析，包括液相和气相色谱 11.2.1 基质消减　　　　　　　 HPLC可用分析仪包括紫外检测器