第八章几种显微技术的应用教学课件.ppt

荧光显微镜标本制作要求 载玻片 　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。 盖玻片 　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，即表面镀有氟化镁的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光又可激发标本。 标本 　组织切片或其他标本不能太厚。如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 封片剂 　封片剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封片剂。 镜油 最好使用特制的无荧光镜油。 使用荧光显微镜的注意事项 　1.严格按照荧光显微镜要求进行操作，不要随意改变程序。 　2.点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，再开始观察标本，最好在暗室中进行。 　3. 在调整光源时应戴上防护眼镜，防止紫外线对眼睛的损害。 　 * * 第八章 几种显微技术的应用 明视场研究用显微镜的操作技术 镜检顺序 1.打开主电源开关 ，在打开之前，应先将右侧电压升降拉杆放在最低处，再打开主机开关，并逐步升高电压。 底座上发光二极管可显示当前电压值。 2.把标本固定在载物台上 3.用10X物镜对焦，将10X物镜引入光路，先粗调，再微调达到最清晰。 4.双目镜筒间距和视度差的调节 5.根据要求放大倍数，旋转物镜转换器，使所选物镜进入光程，再进行微调，使标本清晰。光亮不足，可增大电压或取掉ND滤光片。 聚光镜的调节 聚光镜位置调节 ①缩小视场光阑，视场中出现一个正多边形，若边缘不清楚，表明聚光镜的位置不合适。 ②慢慢向上或向下调整聚光镜，使多边形边缘逐渐达最清楚；这样聚光镜就处于正确位置。 视场光阑处于最大状态 缩小视场光阑 聚光镜中心位置调节 ①将视场光阑缩至较小状态。 ②旋转两个聚光镜中心调节螺丝，把正多边形的视场光阑像移到目镜中心。 ③慢慢开启视场光阑，直至目镜视场与正多边形的视场光阑像外切。 中心调节螺丝 视场光阑的调节 调节照明范围，按物镜情况缩小视场光阑，遮断多余的光线，从而获得分辨率和反差好的像，且增大焦深。标本反差低时，在摄影时以视场光阑像占目镜视场以70～80％为宜。 视场光阑像 目镜视场 孔径光阑的调节 通过物镜的数值孔径与照明系的数值孔径相对应，可得到分辨力和反差好的像，并可增大焦深。显微标本一般反差较低，调节时可使孔径光阑像占物镜光瞳的70—80％较合适。 物镜光瞳 孔径光阑像 浸油物镜的使用 ①先用低倍物镜对焦。 ②在标本上滴上浸渍油。 ③旋转转换器，把浸油物镜引入光程，用微调旋钮对焦。 浸油聚光镜的使用 先把标本从镜台上取出，把油滴在聚光镜的前透镜上，再把标本放到载物台上，慢慢升高聚光镜，直到与载玻片接合为宜。 使用完后用无水乙醇与乙醚(3：7)混合液擦去浸油。 观察中滤色片的使用 (1)防止耀眼和减轻眼睛疲劳。 防止耀眼：采用乳白色玻璃或毛玻璃滤光，也可用滤光镜。 减轻眼睛疲劳：根据标本颜色选用绿色、黄色或兰色滤光片，把刺激眼睛的红光吸收掉，以减轻眼睛疲劳。 (2)增进分辨力。将白光中波长较长的光波吸收掉，利用短波光照射，如绿色或兰绿。 各类滤色镜 （3）增大反差：选用与标本颜色互补的滤光片。 标本颜色 波长（毫微米） 滤光片颜色（标本的互补色） 紫色 380—430 黄色 蓝色 430—490 青 490—510 橙色 红色 绿 510—570 紫红 黄色 570—600 紫蓝 橙色 600—620 青色 红色 620—750 荧光显微镜的原理及操作技术 荧光的产生 被检物体接受一定波长的激发光，吸收能量变成高能态，立即放出能量，发出长波光，发出的长波光称为荧光。 一次荧光(固有荧光或自发荧光) 一些物体经过短波(紫外线)照射后，本身就能产生荧光. 第二次荧光 很多被检物必须事先用荧光物质进行处理，再经紫外线等短波光照射，才能产生荧光。 落射式荧光显微镜 落射式荧光显微镜原理 分色镜的作用 分色镜放在镜筒中间与入射光线成45o，使入射光线反射并发生方向变化，照向被检物体，它具有使短波光反射，长波光透过的作用。 激发滤色镜作用 装在激发光的光路中，阻止长波光的透过而使短波光通过。 吸收滤色镜的作用安装在观察长波光光路中，吸收短波光，让长波光透过。 荧光显微镜的特点 光源 光源是短波光，一般采用100W或200W的超高压汞灯。 激发出的光谱是紫外、紫兰及部分强可见