1植物基因工程.ppt

报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 目前最常用的报告基因有： ? -葡萄糖苷酸酶基因（gus） 荧光素酶基因 绿色荧光蛋白基因 ? -葡萄糖苷酸酶基因（gus） gus基因编码? -葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多? -葡萄糖苷酸类物质的水解，其水解产物大多具有催化荧光反应的能力。绝大多数的植物细胞内不存在内源的活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。 转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析 A B C a b c a b c a b c A, 根系； B, 茎杆；C, 叶片。a, Gus 基因由35S启动子驱动； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。 A, roots; B, stems; C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively; c, no-transformed plants as negative control. 荧光素酶基因 该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物总成，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测。 插入了萤火虫荧光素酶基因的烟草,由于荧光素酶基因的表达使得烟草发光． 绿色荧光蛋白基因 绿色荧光蛋白报告基因 GFP 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。GFP蛋白质本身发光，比荧光素酶原理上有重大突破。 2008年10月8日，日本科学家下村脩、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖 1.3.4 转化体的鉴定和证实 转化体的鉴定和证实的必要性 为了验证外源基因整合到染色体，我们采 用PCR技术 ，Southern杂交技术。 为了验证外源基因是否表达。我们采用 RT-PCR技术，Northern杂交技术，Western杂 交技术。 PCR检验外源基因的整合 在转基因个体的检测中，采用PCR技术可以判断外源基因是否整合到受体植物的基因组。 优点 ：由于对模板DNA的要求少，适合与转基因体的早期检测。 缺点：容易受到外界因素的干扰。 PCR是在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。 逆转录PCR，(RT-PCR)，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。 2.0kb 1.0kb 0.5kb 转基因植株中Gus基因的PCR检测 PCR analysis of Gus in putative transgenic plantlets M, DNA marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植株。 M, DNA marker; P, PCAM-Gus1 plasmid as positive control; CK1,the templete is water as negtive control; CK2, non-transformed plantlet as negative control; 1-6, putative transgenic plantlets. M