9.蛋白之间相互作用2009.ppt

中英联合实验室 (1) 酵母双杂交技术原理 许多真核生物的转录激活因子(transcription activator )都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的，其中有DNA结合结构域(DNA binding domain，简称BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称AD)，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白,并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 (6) 酵母双杂交技术在蛋白质组学中的应用 在实际中酵母双杂交得到了很广泛的应用，尤其是在大规模分析蛋白质间相互作用的蛋白质组学的研究中的地位不可替代。全基因组序列的获得促进了大规模研究蛋白之间的相互作用，全面详尽的蛋白质相互作用图谱被称为互作组(interactome)。在病毒、细菌、酵母和线虫中都已经有大规模的酵母双杂交分析的报道。 致人胃病的幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)的序列在1997年已经测序完成，但对整个基因组序列编码蛋白质的功能知道的还很少。 (7) 蛋白质间连锁图的建立 分析蛋白质相互作用的目的是为了构建蛋白质间相互作用的连锁图。因为蛋白质相互作用控制着生命的各个过程。蛋白质间相互作用是细胞生命活动的基础和特征。例如；代谢和信号途径、形态发生途径、结构复合体和分子机器、DNA的合成、基因转录激活、蛋白质翻 译、修饰和定位、信号转导、细胞周期调控、中间代谢等重要的生物过程都涉及到发白质的相互作用。 蛋白质相互作用连锁关系的揭示已成为蛋白质组学的一个重要的研究内容。 用酵母双杂交及其他方法得到的蛋白质相互作用产生了几个数据库，（如 Hybrigenics, http://www.H；和 Myriad Genetics Inc ) 互作网络指明了不同细胞部位间蛋白质的相互作用，最重要的是提供了未知蛋白质的功能线索。 随着蛋白质组学研究的深入发展，在揭示如生长、发育和代谢调控等生命活动的规律上将会有所突破，对探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾病防治和新药开发将提供重要的理论基础。对于鉴定药物目标，蛋白质相互作用数据有潜在的价值。 (2). 实 验 过 程 检测蛋白质的存在 制备总蛋白提取物 相互作用特异性的对照实验 免疫共沉淀的其它分析 检测蛋白质的存在 免疫共沉淀的第一步是准备检测共沉淀涉及的两种蛋白。 通常用 Western blot 的方法检测参与免疫共沉淀的蛋白质的表达或存在。 可用的抗体是那些可以在非变性条件下发生免疫沉淀的。 检测中使用抗体的选择 常用策略是在目的蛋白的N端或C端加上一个短肽或表位抗原-标签。 两种常用的标签是HA((YPYDVPDYA)和c-Myc，(EQKLISEEDL) 分别从流感病毒血凝素蛋白和人核蛋白c-Myc的一段短肽而来的。 不论是转染到细胞内的质粒过表达的蛋白产物，还是细胞内源性基因的表达产物，在细胞内都会特定的定位，而且随着细胞周期的变化、发育阶段的不同和组织分布的差异，同一种蛋白的定位可能还会发生一定的变化。目前，已经发展了多种方法来确定蛋白质在细胞内的分布。 (1).荧光蛋白融合技术 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）由238个氨基酸残基组成，最早从华盛顿星期五港水域的维多利亚水母体内克隆得到。 荧光蛋白不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪、分选表达荧光蛋白的活细胞。 细胞本身没有GFP和RFP基因，将GFP和RFP与目的基因的编码区相连的融合体可以研究目的蛋白的定位。 GFP和RFP蛋白不依赖物种表达，半衰期超过24h，在活细胞内，荧光可持续24h以上，在固定细胞内荧光在数月后仍可检测得到。 研 究 过 程 利用PCR扩增靶基因，引物包含翻译起点和终止位点以及合适的限制性内切酶位点； 扩增的外源基因片段与载体连接； DNA测序确定外源基因序列未发生突变后，从载体上设计的酶切位点切下外源基因； 将外源基因亚克隆到pEGFP-N1和pDsRed1-N1-B载体中，即完成荧光定位表达载体的构建。 通过脂质体介导或其它转染方法，将质粒“单独”和“共同”转染真核细胞； 24～28h后，在常规的透射荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。 荧光融合蛋白方法的优缺点 操作上比较容易掌握，步骤简便。可随时观察，根据荧光表达的强弱