实验二 琼脂糖凝胶电泳5.pptVIP

实验二 琼脂糖凝胶电泳 原理 DNA 分子是两性电解质， 在高于其等电点的溶液（ pH8.0~pH8.3 ）中 ，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离， DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 电泳时DNA 分子颗粒在电场中通过凝胶介质而泳动。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。 DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的常用对数成反比。 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。 DNA的构象 DNA的构象 不同构象DNA分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不同。 迁移速度： 超螺旋的DNA线状DNA 开环DNA 。 琼脂糖浓度 相同大小的线状 DNA片断在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同. 琼脂糖浓度(%)　　　分离范围（kb） 0.3 　　 5-60 0.6 　 1-20 0.7 　　 0.8-10 0.9 　　 0.5-7 1.2 　　 0.4-6 1.5 　　 0.2-4 2.0 　　0.1-3 电泳电压 低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶上泳动速度和电压成正比。随着电压升高，高分子量的DNA片段泳动速度和电压不成正比关系，分辩率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电场电压不要超过5V/CM。 缓冲液 DNA的泳动受缓冲液的组成和离子强度的影响。 最常用的缓冲也是TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。 指示剂 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量，而与琼脂糖浓度无关。 染色 溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物， EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。  EB是强致癌剂。 注意事项实验用具和溶液均有可能受到EB的污染，操作过程应戴手套! LOGO 1、教学目的与要求： 学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。 2、实验原理： 电泳概念及种类 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 琼脂糖是从海藻中提取的、由D-和 L-半乳糖残基通过α和β糖苷键交替构成的线状聚合物。琼脂糖链形成螺旋纤维，然后再聚合成半径为20-30nm的超螺旋结构。干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸变为澄清，室温冷却、凝聚，即成琼脂糖凝胶。 原理 琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 凝胶浓度 DNA分子大小 DNA分子的构象 缓冲液 电泳电压 主要检测：分子量，含量及有无 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套) 1、胶槽准备 ①取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中; ②将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底端和板面有1mm的间隙; ③将胶槽放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备 用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μl，并轻轻混匀。 3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶槽内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。将带凝胶的胶板置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可。 5、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入