慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径.PDFVIP

遗 传 学 报，26(6):634^-642,1999 ActaGeneticaSinica 慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径 对小麦的导入及转基因植株分析 牟红梅 刘树俊 周文娟 文玉香 张文俊 魏荣暄 中（国科学院遗传所植物细胞与染色体工程国家重点实验室 北京 100101) 摘要 慈菇蛋白酶抑制剂A（rrowheadProteinaseInhibitor,API)是来源于慈菇S（agittaria tr扣lia）储藏器官 根（茎）的一种天然抗虫物质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类，能抑制胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶和激肚释放酶，对某些鳞翅目、双翅 目以及鞘翅 目等昆虫有毒杀作用。通过花粉 管途径，将构建的含抗虫基因API-A,API-B和选择性标记基因NPT-II的质粒pBIAH-A(B)导 人3个冬小麦品种J（D-1,8866,866554)，通过卡那霉素抗性的筛选和聚合酶链反应P（CR)技 术分析表明，Kmr绿苗中有3株为PCR阳性株 8（66554有2株，JD--1有1株），阳性率为0.29%. 用API基因的片段为探针，对Kmr绿苗分别进行基因组DNA的Southern杂交分析，在3株 PCR阳性株中都检测出了API基因片段的存在，说明了外源目的基因已整合到小麦基因组 中。对转化阳性植株899554-3的自交后代进行了PCR分析和Southern杂交分析，部分植株表 现为PCR和Southern杂交阳性，这表明整合到基因组中的外源基因能稳定遗传给后代。用 ELISA的方法检测与API基因融合的NPT-II基因的表达含量，发现在PCR和Southern杂交分 析为阳性反应的3植株中都显示出NPT-II的高含量，为杀虫基因API在转基因小麦中的整合 提供了进一步证据。 关键词 慈菇蛋白酶抑制剂，抗虫基因，小麦遗传转化，花粉管通道法 分类号 Q78 小麦是重要粮食作物，通过遗传转化可使其具有抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂等特性， 并使蛋白质、油脂及碳水化合物诸成分和雄性不育性得到改良。但小麦转化技术起步较 晚，主要是因为用于双子叶植物的一些转化方法移植到单子叶植物尤其是小麦时遇到了 困难。目前的转化技术大多是建立在胚性细胞系、悬浮细胞系和原生质体培养和植株再 生基础上的遗传转化，虽然小麦原生质体再生植株在1988年获得成功P1［，但实践证明用小 麦材料建立这些体系比其他作物都困难得多。 花粉管通道法是一种建立在不依赖于植物细胞和组织培养的转化系统，是根据植物 远缘杂交的理论提出的[2,［31。现在国内外有大约40多家实验室在开展这个方面的探讨。 但目前，花粉管通道法存在着诸多争议，关键在于该法重复性差，转化效率低，转化方法不 成熟且缺乏理论依据。早期花粉管通道法的供体大多数是总DNA4(,51，转化体只是从表型 变异予以证实，缺乏必要的分子生物学证据。由于许多偶然因素、环境因素或 自然突变也 本文于1998-03-14收到，1998-08-18修回 6期 牟红梅等：慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径对小麦的导人及转基因植株分析 635 能改变植物表型，故表型变异因遗传物质的进入所致，一直为人们所怀疑。鉴于此，在80 年代后期有关花粉管通道法的报道大都采用含标记基因的质粒，并提供一定的分子生物 学证据，有的还给出转化后代的遗传分析 一“〔川。 我们实验室 自1991年起，先后在多种小麦品种中进行了花粉管通道法转化，并研究 了外源基因在转基因小麦中的甲基化修饰[10［1。本文采用花粉管通道法将慈菇蛋白酶抑制 剂 A（PI)基因转人小麦，并对转化后代进行了分子遗传学分析。 1材料和方法 1.1植物材料 转化受体是冬小麦品种8866,866554和京冬 1号 J（D-0。其中8866和866554是北 京市农科院经区试的品种。 1.2 质粒材料 pBIAH-A和pBIAH-B分别含慈菇蛋白酶抑制剂基因A,B图（1)，由上海生化所龚纂 摹实验室构建并惠赠。本实验室把该质粒转入大肠杆菌K802菌株。 图I质粒pBIAHA(B)携带的嵌合基因的酶切图 Fig.1 RestrictionmapofplasmidpBIAHA(B)carryingchimericalgen