97组织纤维溶酶原激活物t.pdf

【名称】组织纤维溶酶原激活物 【英文名】tissue plasminogen activator activity 【别名】t-PA 【概述】 组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分 泌，不断释放入血液，广泛存在于机体的各种组织内，肝脏是组织纤溶酶原激 活物灭活的主要场所。它对纤维蛋白有高度亲和力，然后将酪氨酸纤溶酶原形 成纤溶酶。降解纤维蛋白(原)和部分凝血因子。是纤溶系统的关键物质。 【原理】 (1)活性测定 (t-PA∶A，发色底物法之 )：血浆优球蛋白部分含有包括 t- PA以及全部凝血因子，但不含 PA抑制物。加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的 共价物，样品中之 t-PA易吸附于纤维蛋白，并将血纤溶酶原转变成纤溶酶，后 者使发色底物显色。血浆 t-PA与显色的深浅呈正相关。 (2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二)：在 t-PA和加速剂作用下，纤溶 酶原转变为纤溶酶，后者使发色底物 S-2390释放出发色基团 PNA。PNA显色的 深浅与纤溶酶和 t-PA呈正比关系。 (3)抗原测定 (t-PA∶Ag)ELISA法：本试验根据双抗体夹心法原理，即将纯 化的 t-PA单克隆抗体包被在固相载体上温育，然后加含有抗原的待测标本。标 本中的 t-PA抗原与固相载体上的抗体形成复合物。此复合物与过氧化物酶标记 的t-PA单克隆抗体起抗原抗体结合反应，形成 t-PA-POD复合物。后者可使邻 苯二胺基质液呈棕色反应，其反应颜色深浅与标本中 t-PA含量呈正比关系。 【试剂】 (1)活性测定 (t-PA∶A，发色底物法之 )： ①50mmol/L磷酸盐缓冲液。 ②纤维蛋白-纤溶酶原共价物：375mg/L的纤维蛋白，250μ/L的纤溶酶 原。 ③发色底物：3mol/L S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)。 ④组织纤溶酶原激活剂。 ⑤0.25%醋酸。 5.6IU/ml，S 2.8IU/ml)。 ⑥t-PA标准 1 和2(S
(2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二)： 上海医科大学试剂盒。 ①标准品 t-PA(80IU)。 ②去t-PA人血浆。 ③人纤溶酶原。 ④发色底物 S-2390。 ⑤浓缓冲液 TB。 ⑥加速剂。 ⑦浓抗凝液。 ⑧浓酸化液。 ⑨其他：蒸馏水、50%冰醋酸。 (3)抗原测定 (t-PA∶Ag)ELISA法： ①抗体：抗t-PAF(2b＇) 。
②过氧化物酶抗体复合物抗：t-PA-peroxidase。 ③基质：邻苯二胺。 ④基质缓冲液：0.2mol/L柠檬酸，0.2mol/L 柠檬酸钠缓冲液。 ⑤稀释缓冲液：白蛋白-磷酸盐缓冲液 (PBS-BSA)。 ⑥洗涤液：0.025mol/L 氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。 ⑦t-PA标准：组织纤溶酶原缴活物。 ⑧0.11mol/L 柠檬酸钠溶液。 ⑨30% H O 。

⑩终止液：3mol/L硫酸或 1mol/L盐酸。 【操作方法】 (1)活性测定 (t-PA∶A，发色底物法之 )： ①血浆处理：按表 1 进行操作。 ②操作方法：按表 2 进行 。 (2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二)： ①血浆制备：静脉采血，置于含 1/10体积抗凝液的硅化试管中，尽快低温 分离血浆。取血浆 200μl，加酸化液 200μl，混匀，置－30℃保存。测定时酸 化血浆作 1∶60 稀释。 ②取去 t-PA血浆和 t-PA标准品配制标准 t-PA系列 (表 3)。