刘运辉－微生物多样性.ppt

刘运辉 2009.5.26 背景介绍 文献串讲 问题与讨论 摘要 将分子生态学和宏基因组学应用于微生物多样性的研究已经改变了我们原有的对生物圈的理解。近来，通过运用分子工具，大量的古细菌、细菌以及原生生物被发现。致力于将自然环境功能和系统发生多样性联系起来导致新型代谢类型的发现，同时导致了我们重新评估整个生态学对原有的影响。有趣的是与物种形成和进化趋势相关，最大和最小的系统发生尺度正在显现出来。 有关概念 微生物的多样性：即是指一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化以及它们之间相对的丰度。物种丰度(即群落中物种的数量)和物种均匀度(即群落中物种种群量的大小)是研究群落结构及微生物多样性的两个最基本参数。 分子生态学：分子生态学是应用分子生物学的原理、方法来研究生命系统与环境系统相互关系的生态机制及其分子机制,是分子生物学、生态学等的交叉复合,其典型特色是运用分子遗传标记来检测研究对象的遗传变异特征,揭示事物所隐含的演化规律。 它主要包括分子环境遗传学、分子种群生物学和分子适应三个方面的研究,包含了在生物形态、遗传、生理生殖和进化等各个水平上协调适应的分子机制 环境微生物基因组(或“宏基因组”) 指生境中全部微小生物或样品中细菌和真菌基因组总和 。环境微生物基因组学利用免培养技术直接从环境样本中提取微生物总DNA,将其片段克隆到可培养微生物宿主细胞中,建立宏基因组文库。 　环境微生物基因组学研究过程 环境样品DNA高效率提取纯化 克隆策略 筛选策略 富集策略 研究微生物多样性的意义 对极端环境微生物的研究不仅使人类了解和探索生命的策略和极限，而且为超常物质开发利用提供了资源 微生物可用于监控环境变化，它们的群体通常对环境状况反应迅速，因而是一个地区或历史环境变迁的良好记录 微生物在高等生物的保护和恢复生物学中起重要作用，如人和动物的微生态学则是建立在人体正常菌群和人体建立的和谐的基础上的学科 微生物可作为阐明生态和生物进化原理的模式 微生物菌群多样性研究方法的分类 根据研究技术类型，微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：基于生物或化学的方法和基于现代分子生物学技术的方法。 生物或化学方法包括： 传统的平板计数法 荧光染色法 Biology 微平板分析 磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析方法 脂肪酸甲酯(FAME)谱图分析方法等。 分子生物学方法可归纳为三方面: 一是基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交、同位素标记技术等，可对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。 二是基于PCR 技术的研究方法，这些方法可以将极微量的DNA 进行大量扩增，通过比较分析基因序列的特异性来研究微生物的多样性。 随机扩增多态性DNA 技术(RAPD) 扩增片段长度多态性技术(AFLP) 限制性片段长度多态性技术(RFLP) 末端限制性片段长度多态技术(T-RFLP) 单链构象多态性技术(SSCP) 变性梯度胶电泳DGGE 和TGGE 核糖体基因间区分析(RISA)等 三是基于DNA 序列测定的研究方法，分析具体碱基序列的突变情况，通过与生物信息学结合，进行数据比较分析，找出微生物多样性的遗传进化线索，如元基因组测序技术，成为对难培养微生物或不可培养微生物的系统发育和功能研究的重要方法 根据分析对象范围，微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：一类是用于分析可培养的微生物群落；另一类是用于分析整个微生物群落。 第一类分析方法基于微生物的形态判别和微生物的脂肪酸甲酯谱等；第二类群落水平的生理特性分析、磷脂脂肪酸方法和核酸分析等方法(不需要培养微生物)。 各种研究方法存在的问题 由于环境中大多数微生物处于“存活但不能培养的状态”，因此传统培养法有很大局限性，难以准确研究微生物多样性与其生态功能的关系；磷脂脂肪酸和脂肪酸甲酯分析方法主要应用于微生物群落动态变化的定量分析；Biolog 微平板法主要用于异养微生物群落结构多样性的研究，操作快速简便，但精度一般，只能鉴别能在Biolog 系统内生长的微生物； 分子生物学研究方法的不足 荧光原位杂交用于分析原核微生物的群落结构，精度高，但其应用受到环境样品微生物的生理状态的影响，而且事先要根据已知种属设计探针，不能检测出环境样品中的未知种属； 近年来兴起的基于PCR 技术的分子生物学研究方法如：RAPD、AFLP、RFLP、SSCP、DGGE 等技术已经较为成熟，能鉴定出大部分土壤微生物，且精度高，但这些方也存在不足：(1)每次核酸提取的效率不同，造成结果可重复性差；(2)引物对不同样品的扩增效率不同，引起丰度估计偏差；(3)由于对真核生物核糖体的编码基因及复杂调节机制的研究还不透彻， 因此单凭传统培养的方法或现代的分子生物学技术研究生