细胞原代培养与传代汇.ppt

【注意事项】  1．本实验自始至终要严格进行无菌操作，不能抱有任何侥幸心理，器皿和器械一旦有污染的可能，要勤换或在酒精灯上勤烧烤。配液时所使用的三角瓶瓶口、吸管等都要注意在酒精灯上烧烤。 2．配制液体调试pH值时，要少量多次加入NaHC03，以免过量偏碱造成不必要的液体浪费。 3．待细胞分装到培养瓶后，要在瓶壁的上面做好标记，以便区分细胞的贴壁面，严防在细胞换液时培养液未覆盖到细胞面上，造成细胞干枯死亡。 4．实验操作前，净化台或无菌室要进行紫外灯照射消毒20分钟。 5．实验所用物品，要求全部进行无菌处理。 6．培养过程中要随时注意培养箱的温度，严格控制在37 ℃ ±0.5。 7．在细胞培养操作过程中，严禁说话。 8．培养细胞的冻存和复苏的全部过程，必须在无菌橱中和酒精灯上进行操作，否则容易发生污染，影响冻存质量，复苏后则不易成活。冻存的细胞在复苏时必须尽快融化，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5℃～0℃，以防止冰晶的损伤。同时因冻存液中的DMSO对细胞有毒性作用，所以操作必须迅速。 酶标仪 微孔板震荡器 Culture flask Culture Plate 培养器皿 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 常用玻璃器皿清洗 清洁液的配制 细胞培养基 干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F12等 培养基的选择 没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 血清使用注意事项 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。  血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。  显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 血清沉淀物 如何避免沉淀物的产生? 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。 ?解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 ?请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 ?血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 ?若必须做血