大肠杆菌的λ 噬菌体DNA.ppt

第二节 噬菌体或病毒DNA 一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA （2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因 λ噬菌体基因大致分为4个区： 3、感染周期（溶菌循环） 4、溶源状态的建立 超感染免疫性 插入型载体（insertion vector） 取代型载体（substitution vector） 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. 3、灭活某些与裂解周期有关的基因 将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。 (1)免疫功能失活标记 (cI筛选) 加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑； (2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选） lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。 （三）λ-DNA作为载体的优点 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量 重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易. M13噬菌体的基因组 单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。 M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点： ①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； ②M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； ③M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。 ⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。 含有一个质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方法，复制形成大量的双链DNA分子； 具有小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与操作； 编码有一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带着pUCll8或pUCll9噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； 拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5′-端编码区，故可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组体分子； lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便会以融合蛋白质形式表达，即产生出β半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物； 带有一个M13噬菌体的复制起点，所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中； 练习题 1.列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因 内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克 隆，问（1）涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的 菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选 到含有插入片段的重组体? 3.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大 片段时，YAC具有优越性? 4.如何将野生型的λ-