Chapter 2 蛋白质-3-蛋白质分离技术培训课件方案研究.ppt

Chapter 2 蛋白质;Chapter 2 蛋白质;2.6 蛋白质的分离、纯化; 研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。 因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质进行的分析鉴定。; 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)分离和纯化过程都必须0－4℃的低温下进行。;1．蛋白质的分离步骤;2．蛋白质的纯化方法;透析法; 凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。;;凝胶过滤层??;; 蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性分子。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但球形分子比线性分子的分离度好。;此法是利用离子交换剂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。 带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，或是改变流动相的PH值，或是同时采用这两种方法，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。;;离子交换层析;;这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。 将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。 被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液或高盐溶液洗脱。;;+;;在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。 常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等。;① SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS)。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。;(1)原理： a.蛋白质分子状态 在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。;b. 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂—?-巯基乙醇(?- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。;c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物( protein-SDS micelles)。 由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。;;d. 聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。 ;(2) 操作过程 制胶 ? 加样 ? 电泳 ? 固定 ? 染色 ? 脱色 ? 计算 ;(3) 结果处理 a. 电泳图谱;b.标准曲线 绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。;(4) 影响因素