DNA测序 化学降解法教程文件.pptx

DNA序列测定DNA的基本单位－脱氧核苷酸磷酸脱氧核糖CGTA含氮碱基胸腺嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤DNA测序：测定未知序列 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定 比较研究 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。●1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。●同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。第二代测序技术三种第二代测序技术对比测序技术454SolexaSOLiD上市时间200520072007价格（万美元，2007）504559单次反应数据量0.42050读长（bp）40050*250优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度第三代测序技术 第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。 Maxam-Gilbert DNA 化学降解法直接或间接特异性识别4 种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5‘或3’)打断磷酸二酯键基本原理：将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。操作步骤 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序① 先用限制性内切酶把DNA切成10—200bp 的测序材料；② 用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸；③ 在5′OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④ 标记片段变性为单链；⑤ 用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段， 产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段；⑥ 经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。 如果加入高浓度的盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。 在高温强碱作用(90℃,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱哌啶甲酸(90℃,1mol/L)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂 胸腺嘧啶胞嘧啶?硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2]： 一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N７甲基化，但是鸟嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。热哌啶：使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。DNA化学降解反应体系反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 GG+A甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和AC+T肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和TC肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 CA C肼 90?C, NaOH (1.2M) 断裂反应 DMS（硫酸二甲酯）在中性pH环境，主要作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。 甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。 肼，在碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶。 在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G+A反应---