DNA的粗提取与鉴定_实验报告教材课程.ppt

DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 3、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反 ①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 ②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 4、DNA在酒精溶液中的溶解性 5、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 ②大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响 6、DNA的鉴定 DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 二、实验设计 （一）实验材料的选取 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料） 2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大 ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜 2、植物细胞 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解 ②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ （三）去除滤液中的杂质 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离 （四） DNA的析出与鉴定 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ％） ，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出 2、 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色 鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 2mol/L 鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 5、过滤→取纱布上的滤物 纱布过滤 6、再次溶解DNA 2mol/LNaCl溶液 取滤物 鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 7、加冷酒精使DNA析出（纯化） 冷酒精 鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 DNA的鉴定 DNA的粗提取与鉴定 实验原理 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同 DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同 DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同 DNA与二苯胺呈现蓝色反应 DNA粗提取 选择适宜材料 破碎细胞 DNA的溶解和析出 DNA的纯化 鉴定DNA 与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应 总结： 方法步骤 加入物质 目的 1 . 制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 ① 2 . 提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 ② 3 . 溶解细胞核内的 DNA 2 mo1 ／ L 的 NaCl