免疫药实验方法-药理实验方法学-研究生培训课件方案研究.ppt

* 2 分光光度法 【基本原理】 又称SRBC的定量溶血测定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体，较溶血空斑法精确。同时操作比较简便。 * 【操作步骤】 （1）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5×106/ml脾细胞悬液，或按15mg脾重/ml制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应：取试管若干只，每管依次加入脾细胞悬液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混匀，另设不加补体的空白组。置37℃水浴中温育1h，离心3000rpm，5min。 （4）测OD值：取上清测OD413nm。 * 【注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。 （2）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作适当调整。 * 三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验（3H-TdR掺入法） 【基本原理】 淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养液中加入3H-TdR，使其掺入到新合成的DNA中，可以定量细胞内的DNA合成强度。 * 有丝分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T细胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T细胞 LPS（脂多糖） ――刺激B细胞 * 【操作步骤】 （1）纯系小鼠，2～3月龄，雌雄均可。处死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入盛有RPMI1640培养液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器针芯捣烂，过100目钢筛，制成脾细胞悬液。 （2）用培养液离心洗涤脾细胞3次，用台盼蓝检查活细胞数在95％以上。将细胞用培养液稀释成2×106个/ml。 * 第二节 实验方法 一、影响非特异性免疫功能实验 （一）碳粒廓清法 【基本原理】 网状内皮系统（RES）是机体最主要的防御系统，具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质。 当静脉注入特定大小的惰性颗粒后，它即可被RES细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测定血流中炭粒的消失速度来反映RES吞噬异物的能力。 * 【实验步骤】 （1）取小鼠，随机分组，给药。 （2）末次给药后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g体重。 （3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶静脉取血20ml，加到2ml 0.1%NaCO3溶液中摇匀。 （4）测OD680nm，计算廓清指数（K）、吞噬指数。 * 廓清指数K＝ ＝ 吞噬指数α＝ × 即校正廓清指数 * 【注意事项】 （1）印度墨汁应用NS稀释1～5倍左右，最好经超声处理后离心，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛细血管，引起动物猝死。 印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨汁颗粒大小有严格要求，过大则不被吞噬，过小则被其他吞噬细胞吞噬，如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒大小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而适用于本实验。 （2）iv要熟练，印度墨汁的剂量、取血时间必须准确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至10分钟。 * 【评价】 印度墨汁法测定RES吞噬活性是最经典的一种免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，结果可靠，重现性好。 若再配合小鼠腹腔巨噬细胞吞噬消化鸡红血球实验及白细胞游走实验，则可较全面地反映单核巨噬细胞系统清除异物功能状态。 * （二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法 【基本原理】 Mφ具有强大的吞噬能力，鸡红细胞对鼠类是一种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞（CRBC），隔一定时间后，吸取腹腔Mφ，镜检其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示Mφ吞噬能力的大小。 * 【实验步骤】 （1）取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分组。 （2）若筛选免疫抑制药，预先用Mφ诱导剂，可在实验前3～4天，ip0.5％淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，ip，5％ CRBC 0.5ml。8～12h后脱颈椎处死小鼠，ip2ml NS，轻揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于两片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。 （4）用NS漂洗，除去未粘片的细胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。