南农 生物技术制药 第二章基因工程药物案例实例.ppt

第二章基因工程与药物蛋白生产Genetic Engineering in Medicine and Industry ;;Genentech 公司;Genentech的骄人业绩;美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）;;;;;;一、基因工程与医药卫生;*;二、基因工程菌大肠杆菌表达系统;一：大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物;二 大肠杆菌表达载体的基本组成;1启动子 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。;b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。;在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。;3转译起始序列;4、reporter gene;三 常用的大肠杆菌表达载体启动子;图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号;图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较;图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达;图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合成;图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题;图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子;四 真核基因在大肠杆菌中的表达 ;1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm ;周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。;3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。;目的蛋白稳定性高: 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整;外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达; 外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多;分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象， 对蛋白酶不敏感;重组大肠杆菌 --目的蛋白完全分泌;二种类型 由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。 由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。;attention;使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。 可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。 可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。 能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。;3 整合型异源蛋白的表达;转位因子依赖型的体内重组;生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子;转位因子的结构;整合形式; ;1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；;结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学功能的丧失;受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解;以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞;根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素);使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度;1982年 , 美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。;;基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列;由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。;基因工程菌的构建战略 ;表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感;在人胰岛素原