细胞因子、抗体检,ELISA.ppt

细胞因子的检测方法： 1) 生物学方法 ①依赖性细胞株 ：生物分析法 ②功能检测 ：生物分析法 2) 分子生物学方法 ①分子杂交技术 ：mRNA的测定 ②多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定 3）免疫学方法 ①免疫测定 ：免疫酶技术 ②功能测定与抗体抑制 抗体检测技术 1）免疫酶技术 2）免疫荧光技术 3）间接血凝试验 4）放射免疫测定 5）蛋白印迹 6）免疫共沉淀 实验原理 ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性 按一定步骤进行抗原抗体反应 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析 方法类型 ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法： 1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法 一、试剂及仪器准备 （一） 免疫吸附剂 1.固相载体 ⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应 ⑵ 载体性能比较 ① 载体材料：+、- 结果差别大 ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10% ⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： ⑴ 包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后在用1—5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰 ㈡ 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2. ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm) 四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黄色) α-萘酚(红色) 3-氧基-9-乙基卡唑(红色) 4-氯-1-萘酚(灰蓝色) AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 ?-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-?-半乳糖苷：荧光 4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法 （三）设备： 酶标比色仪简称酶标仪 指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确0.001，准确性为±1%，重复性达0.5% 操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读 二、操作步骤（间接ELISA法） 1.样本的收集； 2.包被抗原； 3.封闭； 4.加稀释的待检样品； 5.加酶标抗抗体； 6.加底物显色； 7.终止反应 （一）样品的收集和保存： 1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)； 2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-” (破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)； 3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”； 4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本 底增加； 5. 标本中含NaN3，可出现假“-”。 （二）包被 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体