研究生 核酸适配体分析 9.pptVIP

第9-11章 核酸适配体分析 内容提要 9.1、Aptamer 9.2、DNA杂化检测 9.3、纳米金标适体探针检测汞离子 9.1 Aptamer 核酸适体（aptamer），又名适配体，又称“化学合成抗体”，是一段由20-100个碱基组成的单链寡聚核苷酸。它通过指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来的。它能特异性地结合蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体，其解离常数很小（nM或pM级）。 它识别分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸类配基具有更多的独特优势： (1)不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，不易变性和降解且复性可逆； (2)亲和力及特异性易控制,并能通过合理设计或分子进化技术加以提高； (3)它能通过官能团或标记物修饰直接共价结合到芯片上，易于长期保存和室温运输； (4)理论上所有靶分子都可筛选到相应的适配体，包括非免疫原性或毒性蛋白质。核酸适配体的靶分子更为广泛，可以是蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物甚至金属离子、细胞、细菌等。 aptamer-靶分子之间可以达到很高的亲和力，甚至高于抗原-抗体之间的结合。核酸适配体比抗体具有更高的特异性，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得核酸适配体在基础研究、临床诊断、药物研制方面得以广泛应用。 一、Aptamer合成——SELEX技术 DNA适体与RNA适体的筛选过程虽然有一点不同，但一般都包括以下几个步骤：(1)通过人工合成，建立ssDNA随机序列库，库容量通常在1014-1015之间，每条序列由两端的恒定区和中间的随机区组成，随机区的序列长度一般在30-40nt之间，恒定区为PCR扩增所必须。若使用RNA文库，则需在一端的恒定区加入噬菌体T7启动子，可使DNA文库转化成RNA文库。(2)与靶物质反应，筛选出相互结合的靶物质-核酸复合体。筛选技术包括硝酸纤维膜过滤结合（nitro-cellulose filter binding），亲和层析（affinity chromatography）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（electro-phoresis on native polyacrylamide gels）、按相对分子质量（Mr）分级过柱（size fractionation on columns）等等。(3)将筛选到的蛋白-核酸复合物分离，得到的核酸进行PCR扩增，变性成单链以准备进行下一轮筛选；若筛选对象为RNA，则需先反转录为DNA，然后扩增成为dsDNA并进行体外转录和下一轮筛选，筛选的次数由文库的类型和每次循环所得特异性序列的富集程度决定。(4)经过若干轮筛选得到的、能高度结合靶物质的核酸配体可以进行测序并用于各种研究工作。（SELEX技术路线见图2） 二. Scheme of aptamer synthesis Introduction of PCR (polymerase chain reaction) 三、Aptamer 与靶分子相互作用 Aptamer与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发卡（hairpin）、假结（pseudoknot）、凸环（stem loop）、G-四分体（G-quartet）等。 Model for the Interaction between aptmer and target molecule 四、凝血酶ssDNA-aptamer 图1所示的是凝血酶ssDNA-aptamer的空间结构示意图，它主要由29个脱氧核糖核苷酸组成，形成了含有两个G-四分体结构的特殊三维结构。 图1 凝血酶ssDNA-aptamer 9.2、DNA杂化检测 DNA是遗传信息的承担者，DNA分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关。因此，对特定序列DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗以及病原基因的测定方面具有十分深远的意义。目前，基于核酸杂化已建立了高选择性检测DNA的荧光成像、电化学、微重量、化学发光、电致化学发光法等。尽管如此，将现代分析新技术与DNA杂化相结合，探究简便快速、高灵敏、高选择性的DNA检测新方法，满足不同研究的需要，仍是分析化学面临的挑战性课题之一。 (一) 基于DNA杂交原理和纳米金