第五章 基因操作.ppt

第五章 基因操作 1 DNA克隆、宿主、载体与工具酶 2 体外重组 3 DNA克隆及筛选 4 基因操作技术的应用前景 基本概念： 基因操作技术是指对特定基因的分离与纯化、测序与鉴定、扩增与克隆、转化与重组等技术方法的总称。在应用层面上也称为基因工程。 基因操作技术的目的有二：一是分子生物学研究方面，主要是对特定基因进行结构与功能分析；二是产业化应用方面，主要是转基因生物及其产品的商业化开发。 随着分子生物学理论研究的深入、技术方法的更新和工程学手段的进步，基因操作技术的应用已深入到社会生活的方方面面。 基因操作的缘由： ※蛋白质在生物功能上是最重要的生物大分子，但直接分析蛋白质的结构与功能面临着极大困难： 细胞所含的蛋白质种类繁多，但大部分含量稀少； 不同组织细胞所含蛋白质有所不同； 蛋白质提取过程往往发生结构变化和活性下降。 ※基因操作在DNA水平上，比操作蛋白质更有优势： 同一个体或克隆的细胞中的基因组DNA是同质的，DNA分离纯化相对于蛋白质更为简便； 可以通过对特异片段的体外扩增分离特定的基因； 可以通过对靶基因的人工操作研究对应的蛋白质的结构与功能，或通过异体表达收集足量的蛋白质进行研究，或进行商业开发。 基因操作需要载体、宿主细胞和特定的工具酶 1 DNA克隆、宿主、载体与工具酶 1.1 DNA 克隆 克隆是指一个遗传性一致的生物群体，或是从单一生物体通过无性生殖形成的群体（株系）。 DNA克隆是具有同一DNA分子(或片段)的制备物，或者是含有某一相同DNA(或片段)的细胞群体。 DNA克隆制备是指对基因组中特定DNA片段或基因的扩增并保存在所选定的细胞群体中。 DNA → 特定片段 —┬→ 重组体 —┬→ 转化子 提取 扩增(PCR) ↑ DNA ↑ ↓ ↓筛选 ↓ 细胞克隆(已知) ←←┬←← 重组转化子 1.2.2 载体：细胞中自主复制的小分子DNA。 * 载体易于从宿主中分离并带选择标记(常双标记)； * 载体含有一至多个内切酶位点(外源DNA插入点)； * 载体在宿主内有高的复制率。 * 常用载体：质粒、噬菌体、BAC、YAC、Cosmid等。 理想载体: ? 高复制率; ? 多种限制酶位点（每种一个） ? 选择性标记(双选择－－转化子选择、靶DNA选择) ? 容量较大（可接受大片段外源DNA → 细菌质粒 10 kb → λ噬菌体 23 kb → Cosmid 30 - 45 kb → BAC 350 kb → YAC 1000 kb 质粒载体容量为1至几个基因，适合于对小基因组进行文库构建。 1.3 基因文库 * 一个基因文库包括一个基因组的全部DNA克隆。 * 基因文库中每一个克隆含有一个基因组DNA的随机片段。 * 以基因组DNA随机片段构建的基因文库称为基因组文库。 * 以cDNA构建的基因文库称为cDNA文库。 基因组文库 基因组 ―→ 内切酶 ―→ 随机―→ 载体―→ 转化 → 克隆 DNA提取 切割 DNA片段 连接 ↓ 筛选