第六章 基因工程制药工艺.ppt

生物制药工程 杜秉海 刘 凯 生命科学学院微生物学系 山东省农业微生物重点实验室 第六章 基因工程制药工艺 基因工程制药微生物表达系统 基因工程大肠杆菌的构建技术 基因工程菌的发酵培养与控制 第一节 基因工程制药微生物表达系统 基因工程菌： 以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的，表达外源基因、过量表达或抑制自身基因的工程生物体。 工程菌种类： ?基因工程大肠杆菌和酵母： 重组蛋白质药物生产。 ?基因工程技术改造出发菌： 抗生素、甾体激素、氨基酸、中间体生产。 1. 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌（E.coli)形态特征 细胞：G-，单细胞，杆状；无芽孢，鞭毛，一般无荚膜；裂殖。 菌落：白色至黄白色，光滑；直径2-3mm。 生化与遗传特征 能在仅有碳水化合物、氮磷及微量元素的极限培养基上生长； 基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质； 染色体DNA环状双链，核外遗传物质为质粒； 基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株。 质粒载体（Plasmid vector) 复制子 选择标记 多克隆位点 质粒载体的基本特征 1）自主复制性 2）选择标记 3）多克隆位点 4) 不相容性 5) 转移性 质粒类型 1) 严谨型质粒： 每个细胞含少数拷贝； 2）松弛型质粒： 每个细胞含几十至几百拷贝； 3）克隆质粒： 克隆和扩增外源基因 4）测序质粒： DNA测序 5）整合质粒： 用于外源基因与宿主染色体整合 6）穿梭质粒： 能在两种细胞中存在； 7）表达质粒： 用于表达基因产物。 表达载体MCS附近结构 1) 功能基因 2）上游启动子 3) 下游终止子 产物表达形式： 不容性蛋白质：细胞质内形成包涵体； 可溶性蛋白质: 分散于细胞质中； 周质表达：外源蛋白被运输至周质，可溶性； 胞外表达: 胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中。 优点 1）发展最早、应用最广泛的典型表达系统； 2）遗传背景清楚、表达水平高； 3）培养周期短、抗污染能力强； 不足 1)不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达； 2)细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素、 具有抗原性，产生热源； 3）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应。 应 用： 大量外源基因能超量表达，18种药物已上市， 包括多肽类药物【甲状旁腺激素（1-34)、利尿钠肽】、 激素（胰岛素、生长素）、 细胞因子类（干扰素、白细胞介素）、 溶栓酶类（rPA)、 白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。 2. 酵母表达系统 形态特征 细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵圆形； 繁殖：芽殖、裂殖；特定条件下形成子囊孢子； 菌落：乳白色、有光泽、边缘整齐。 生长与遗传特征 两个异性单倍体细胞结合形成二倍体接合子； 能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等； 生长繁殖快，倍增时间2h左右； 酿酒酵母有16条染色体； 1996年完成基因组测序，遗传背景相对清楚； 基因组：120.68Mb,5887个ORF，编码约6000个蛋白质。 表达载体 含有复制起始序列或整合 序列、选择标记及 由启动子、终止子和信号 肽序列构成的表达盒序列。 四种类型： YIp 酵母整合载体； YCp酵母着丝粒载体； YRp酵母复制载体； YEp酵母附加载体. 优点 载体安全、无毒； 营养缺陷选择标记； 培养条件简单，大规模培养技术成熟； 亚细胞器分化，蛋白质翻译后进行正常修饰和加工； 具有良好的蛋白质分泌能力； 不足 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵； 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。 应 用 已用于生产人干扰素、人胰岛素、尿酸水解酶、血小板衍生生长因子、高血糖素、乙肝疫苗等。 小 结 表达系统：宿主菌+表达载体。 生物学和生产特征。 大肠杆菌表达系统。 酵母表达系统。 思考题 分析比较基因工程大肠杆菌表达系统和酵母表达系统制药的优缺点，如何选择应用？ 分析两个表达系统的应用前景。 第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术 工程菌构建流程 目标基因的克隆 表达载体构建 工程菌构建 DNA酶切、连接，形成重组DNA分子； 导入宿主细胞中，进行扩增； 目标基因表达，形成新产物，产生新性状。 基因工程技术—DNA重组示意图