未知基因克隆策略及进展.ppt

2、机械剪切（eg. 超声处理） 优点：保持随机性 缺点：两端差不齐，不加修整难以克隆 3、部分酶切 即某一识别序列很短的RE不完全酶切DNA仅使 其相应的酶切位点只有少部分被打断。 （eg. Sau 3A识别4bp即每256bp中就有一识别位点〕 优点：a、保持随机性 b、两端有粘端，易克隆 c、群体较小易筛选 * 未 知 基 因 克 隆 策 略 Bait Gene Pool Example:How the normal cell transformed into tumor cell? Normal tissue Tumor tissue ? Screening the library Comfirm and analysis of the target gene Select the materials containing the target Gene Genomic library cDNA library cDNA文库的构建 cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，形成的互补DNA（complementary DNA， cDNA） 优点 1）无内含子、片段短、易操作。  2〕某特定基因在mRNA中的拷贝数＞在基因组 中的拷贝数。 3）由于成熟mRNA是转译成蛋白质的直接模板， 可从cDNA序列中直接找到编码区，推测蛋 白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。 选择含有目的基因的组织或细胞，分离mRNA 以上述mRNA为模板，逆转录合成第一链cDNA 合成第二链cDNA 将合成的cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，构建cDNA文库 1、从目的细胞中分离 mRNA 2、合成cDNA第一链 3、合成cDNA第二链 4、双链cDNA转入载体，转化大肠杆菌，形成文库 PCR法 RACE 目的基因的筛选 1、杂交筛选 （1）核酸探针筛选 1）适用范围：对所需筛选的目的基因序列有所了解，或已获得部分基因片段，想要克隆该基因全长cDNA或基因组基因时使用。 （2）寡核苷酸探针筛选 1）适用范围：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作为探针 2）原理同上节 3）注意事项： a ．探针足够长（＞18个碱基） b．注意密码子的简并性 2、抗体筛选（1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。（2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体屯构建成表达文库，用能与目的基因表达产物特异结合的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克隆。 3、差异表达DNA片段的筛选 适用范围：筛选不同组织之间或同一组织在不同状况下表达有差异的未知基因。（1）差示筛选 原理：分别以两个需比较样品的mRNA为模板，合成各自的cDNA放射性标记探针，与其中之一的cDNA文库进行原位杂交，根据杂交信号的差异，挑选表达差异的克隆。 （2）差别显示反转录PCR（DDRT-PCR） 原理：每条成熟mRNA的尾部均有polyA尾，除此以外，各基因mRNA的序列各不相同；据此，PCR 5’端随机引物与模板cDNA的结合位置距polyA尾的距离也随基因的不同而不同，用两端引物经RT-PCR扩增后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR产物据其分子不同分开，根据一对组织细胞间电泳条带的不同，选出差异表达基因的片段。该片段可作为探针，筛选cDNA文库。 纯化的蛋白质 制备抗体 氨基酸序列测定 设计寡核苷酸探针 筛选cDNA文库 cDNA序列 已知蛋白质功能 功能结合法 已知蛋白质的 表达差异 比较并寻找差异 表达的DNA片段 （四）目的基因的确定及分析 1、DNA的顺序测定——了解克隆的DNA片段的核苷酸一级结构。 2、基因顺序分析 （1）寻找基因的开放读框 （ 2）以核苷酸顺序推测相应蛋白质的氨基酸顺序 （ 3）根据氨基酸顺序，推测蛋白质的种类、性质、 结构、功能。 3、基因克隆的编码产物分析1）在原核或真核细胞中利用全长cDNA表达的蛋白质，显示正确的生物学或酶学