第六章(细胞化学).ppt

《电子显微技术》细胞化学和原位杂交 姚雅琴 一、细胞化学 细胞化学概念 细胞化学（Cytochemistry）：是一种把细胞结构和其原位发生的生化反应有机地结合起来进行研究、揭示细胞结构和其物质功能之间内在联系的技术。 酶细胞化学（Enzyme cytochemistry）：研究细胞内部各种酶的定位以及相对活性。 免疫细胞化学（Immuno-cytochemistry）：根据免疫学原理，利用抗体研究细胞内相应抗原物质的定位及其相对含量。现在也泛指利用分子间特异的相互作用研究有关大分子在细胞内的定位与相对含量。 (一)酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry) 1.作用原理: 酶与特异性底物作用，在反应部位生成一种 不溶性的反应产物。 在电镜下观察时，则要求该不溶性的反应产 物具有较高的电子密度稳定物(重金属) 。 2. 捕捉途径 金属盐法：由重金属盐（例如铅、铈、铜等）作为捕捉物与可溶性的初级反应产物反应, 形成水不溶性的电子致密物沉淀。 ? Ca2+-/ H+-/Mg2+-ATPase: pb2+ + PO42- ? pb3(PO4)2? 氨基联苯胺法 这是一种偶联技术，用氨基联苯胺（DAB ）作底物，形成嗜锇性的吩呔多聚物(Phenazine Polymer),再与锇酸结合形成黑色沉淀。 Peroxidase Cytochrome oxidase: 氧化聚合 nDAB (DAB)n + OSO4 嗜锇性(DAB)n 3. 一般制样程序 取新鲜样品 ? 预处理（除去干扰物） ? 酶反应（添加底物和标记物） ? 固定、脱水、常温包埋 ? 切片、染色、观察分析 5.酶细胞化学 举例 是把免疫学方法与电镜技术相结合，利用抗体检测组织切片或小颗粒性物质中抗原的存在位置。 若想在电镜下找到样品中抗体与抗原的结合位置，必须使抗体与某种电子致密的标记物结合，通过检测标记物来间接确定抗原存在的位置。 免疫胶体金标的类型 分为包埋前和包埋后免疫胶体金标记，后者是应用最广泛的免疫电镜技术。 所谓包埋后免疫胶体金标记是指在超薄切片上进行免疫标记。 可分为直接法和间接法两种： 直接法是用与胶体金交联的第一抗体直接进行标记； 间接法 包埋前免疫标记的优点:  切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。 包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。 典型的标记程序 酶标记免疫电镜技术 将酶和抗体结合，这种酶-抗体结合物仍然保持酶和抗体的活性及特异性； 结合物中的抗体与相应组织或细胞内的抗原特异性结合； 再利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度； 借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。 用于标记抗体的酶的主要类型 有辣根过氧化物酶（HRP）、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、细胞色素C、过氧化氢酶等。 但最常用的是HRP，其稳定性好，分子量小（40kD），其标记抗体可以穿透经适当处理的组织与细胞膜，能用于细胞内抗原定位。 但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高。 酶标的样品处理过程 1．酶标抗体的制备； 2．取材 将培养细胞或组织块用甲醛4℃固定5min～ 1h PBS液漂洗 ； 4．血清孵育； 5．漂洗； 6．2.5%戊二醛再固定15min～30min； 7．漂洗； 8．酶标记抗体孵育（一抗，二抗）； 9．漂洗； 10．酶显色处理 用DAB－H2O2溶液处理 11．漂洗； 12. 1%锇酸 13 常规，脱水、包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引