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真核生物DNA抽提 生物化学与分子生物学教研室 陈佳瑜 讲师 第一部分 DNA提取总论 一、提取DNA总的原则： 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 二、样本来源： 理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA 样本选择取决于试验目的 全血是基因组提取最常见的样本 三、DNA提取的基本步骤： 1、核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法） 各种组织细胞破碎方法 2、核酸的分离与纯化： 从含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤 4、DNA鉴定 DNA的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定 浓度鉴定 1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） 纯度鉴定 紫外分光光度法： 在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比应在1.75－1.80，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。 完整性鉴定 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 5、核酸的贮存——DNA保存 1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2）长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 第二部分 基因组DNA的分离 一、DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 1.生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮 2.培养细胞 悬浮生长细胞：1500g离心，4℃10分钟收集细胞 单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集 3、血液样品 EDTA-Na2 或枸橼酸钠作为抗凝剂 不宜使用肝素 二、DNA提取 （一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。 主要试剂的作用 EDTA的作用： 1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2.降低细胞膜的稳定性 主要试剂的作用 SDS的作用： 1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂 2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来 3.对RNA、DNA酶有抑制作用 4.与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性 主要试剂的作用 蛋白酶K的作用： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用 主要试剂的作用 苯酚的特点： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA 主要试剂的作用 PH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA进入水相，减少DNA在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 DNA的沉淀 1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀