13重组DNA技术new.ppt

第一节 基因工程中的工具酶 限制性内切酶 — 主要用于DNA分子的特异切割 DNA连接酶 — 用于DNA和RNA的连接 DNA聚合酶 — 用于DNA和RNA的合成 DNA甲基化酶 — 用于DNA分子的甲基化 核酸酶 — 用于DNA和RNA的非特异性切割 末端修饰酶 — 用于DNA和RNA的末端修饰 1.? DNA重组 黏性末端能与另一个相同的黏性末端连接。 在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子。 2.??限制酶（物理）图谱绘制 3.??突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切 第二节 载体的选择 载体 (vector) 可携带插入的外源DNA进入宿主细胞中大量扩增的DNA分子。 克隆载体：用来克隆和扩增目的DNA的载体。 表达载体：用来表达目的基因、合成目的蛋白 的载体。 1）复制起始点（ori）； 2）多克隆位点（多种限制酶的酶切点）； 3）选择标记（如抗药基因、酶基因、营养缺陷型、形成噬菌斑等）； 4）较高的外源DNA装载容量； 5）容易进入宿主细胞。 表达载体 ( expression vector ) ( P223 ) 第 三 节 DNA克隆的基本步骤 目的DNA： 是指要克隆或研究的DNA片段。因目的DNA要插入载体导入宿主细胞，故对宿主细胞而言，它又称为外源性DNA。 目的基因： 是一个功能概念，是目的DNA分子所包含的遗传信息。 平端连接 黏性末端连接： 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 同聚物加尾连接: 在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端。 人工接头连接： 由平端加上新的酶切点，再用限制酶切产生粘性末端。 宿主细胞 原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌 可用于扩增、表达 真核细胞：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞 仅用于表达目的基因 转化方式：转化、转导（感染）、转染 原理：细菌处于 0℃ CaCl2 低渗溶液中，细胞膨胀成球形（感受态细胞）。外源 DNA 粘附于细胞表面，通过热激作用促进细胞对 DNA 的吸收。 感受态细胞：指利用理化方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源 DNA 分子的状态，称为感受态细菌。 （2）电穿孔法 利用高压电脉冲使细胞膜吸收DNA分子。 （3）病毒感染法 以λ噬菌体、黏粒、病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成噬菌体颗粒或病毒，再感染适当细胞并扩增的方法。 转染方法：病毒感染、显微注射、穿刺、脂质体介导、磷酸钙共沉淀、电穿孔等。 瞬时转染：指外源 DNA 进入宿主细胞之后独立存在于染色体 DNA 之外。 稳定转染：指外源 DNA 进入宿主细胞之后，进一步整合于染色体 DNA 中。 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)不完整的突变体与编码半乳糖苷酶N-端146个氨基酸的 lacZ’ 基因之间实现互补，从而产生具活性的β-半乳糖苷酶，这种现象称为α-互补。利用生色剂 X-gal 可鉴别转化的成败（即“蓝白斑试验”）。 蓝斑——α-互补——载体的lacZ’未插入外源片段——重组失败 白斑——无α-互补——载体的lacZ’ 插入外源片段——重组成功 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 互 补 黏 端 连 接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 加同聚物尾连接 人工接头链接 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 四、转——外源DNA导入宿主细胞（p218） 1、外源DNA导入原核细胞 （1） CaCl2法 1、外源DNA导入原核细胞 2、外源DNA导入真核细胞 五、筛——细胞筛选和DNA鉴定（P220） 1、平板筛选 （1）普通抗