生物分子的分离纯化培训课件方案研究.ppt

第七章 生物分子的分离纯化;生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）;5）能人工合成与改造。;一、生物大分子的制备;（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备； （2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响;（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。;生物大分子制备的一般步骤： ; 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。;影响提取效果的因素; 生物大分子的分离纯化 ;（2）有机溶剂沉淀法 ;(3) 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。;二、核酸的分离纯化 ;分离纯化的原则 一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。 ;对于核酸的纯化应达到以下三点要求： 1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； 2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。;保持核酸的完整性 在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。;核酸制备的技术路线;核酸的浓缩、沉淀与洗涤;核酸的鉴定与保存;⑵　荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。;⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。 ⑴　紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。 ⑵　荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。;⒊　完整性鉴定 ⑴　琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸???胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。 ⑵　其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等;(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存；在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。;尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯化的一般程序见图7-4。;真核基因组DNA分离纯化的一般技术路线;1、酚抽提法(SDS法）;裂解液中： EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性 SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性; SDS法流程图 （以动物组织为例） ;2、 甲酰胺解聚法; 3、玻棒缠绕法;基因组DNA－其它方法;基因组DNA－其它方法;基因组DNA－其它方法;基因组DNA片段的纯化;回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。 2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。 柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理;从琼脂糖凝胶中回收DNA片段;从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段;质粒DNA的提取与纯化;质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等 这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成;1、