生物化学-重组DNA技术研究报告.ppt

重组DNA技术Recombinant DNA technology 邓益斌 主 要 内 容 掌握重组DNA技术的定义 掌握限制性核酸内切酶的概念 熟悉常用工具酶的种类及用途 熟悉重组DNA技术的基本步骤 第一节 重组DNA技术的定义及步骤 基因重组技术:在体外对不同来源的DNA分子进行共价连接形成重组DNA ，再将重组子导入受体细胞，扩增、繁殖和表达。 基本步骤 2. 将目的基因与运载体DNA在体外进行重组 目的基因 运载体 DNA 限制性核酸内切酶 DNA 重组体 引入宿主细胞 筛选出含有 重组体的细胞 无性繁殖扩增、表达基因产物 3. 转化或转染 4. 筛选 5. 克隆（cloning）基因的表达、检测 、分离 1. 目的基因获得 一、 限制性核酸内切酶 选用II型限制酶，能专一识别和切割双链DNA 限制酶的命名 Haemophilus influenzae Rd 嗜血杆菌属 流感杆菌（种名） 株名 取H 取in d Hind I 第二节 重要的工具酶 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母，需大写；从同一种微生物中发现多种限制酶，依据发现的前后顺序用罗马数字表示：例如从淀粉液化芽孢杆菌（Bacills amyloliquefaciens) H株分离的第一种限制型内切酶，命名为 BamH I II型限制内切酶切割双链DNA产生三种不同的切口 （1）产生平末端： 5’A G C T 3’ Alu I 5‘A G C T 3’ 3’ T C G A 5‘ 3’ T C G A 5‘ （2）产生5’ 端突出的粘性末端 5’GGATCC 3’ BamH I 5’G GATCC 3’ 3’CCTAGG 5’ 3’CCTAG G 5’ （3）产生3’ 端突出的粘性末端 5’GAGCTC 3’ SaC I 5’G GAGCT C 3’ 3’CTCGAG 5’ 3’ C TCGAG 5’ 二、DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I分子量109kD,它具有三种酶活性。 Klenow片段分子量76kD， 它具有二种酶活性（去除5’ 3’外切酶活性）。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80℃），分子量65kD,也具5’ 3’外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’ 5’DNA外切酶活性，具有3’ 5’RNA外切酶活性。 4. 末端脱氧核糖核酸转移酶: 60kD (3’羟基端） 三、DNA连接酶： 1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。 2. 大肠杆菌DNA连接酶 四、T4多核苷酸激酶:催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链5’末端 五、碱性磷酸酶：催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基团 第一部分 获得目的基因 第一节 目的基因的获得 原核生物基因组较小,目的基因定位较容易，一般可直接分离获得。即用限制性核酸内切酶将基因组切成若干片段后，用带标记的核酸探针从中筛选、确定、提纯、扩增。 真核生物基因组庞大，一个单拷贝仅占整个基因组的10-7~10-5，从中获取某一基因常采用以下几种方法： 1. PCR 获取目的基因 2.用DNA合成仪人工合成目的基因 3. 从DNA文库（gene library）中筛选出目的基因 DNA文库 各种重组DNA分子的集合体，叫DNA文库 cDNA文库  基因组文库 将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段 分别与质粒重组并引入大肠杆菌即为基因组文库（G-文库） 基因组文库： 分离纯化基 因组DNA 筛选目的基因 分离纯化mRNA 用oligo-dT亲和层析法 提取细胞 内总RNA 反转录合成cDNA并复制成双链的DNA 与质粒重组并引入大肠杆菌