内分泌与代谢病学专业优秀论文 放线菌素dtnf-α诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究.doc

内分泌与代谢病学专业优秀论文 放线菌素D/TNF-α诱导小鼠胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究 关键词：糖尿病 MS-1细胞 肿瘤坏死因子α 放线菌素D 胰岛微血管 内皮细胞凋亡 靶向治疗 摘要：胰岛是高度血管化的微器官，胰岛微血管内皮细胞（islet microvascular endothelial cells，IMEC）是胰岛微血管的主要组成部分，不仅具有血管内皮细胞的一般性质，如血管生成、止血的作用，而且担负着营养β细胞、分泌诱导胰岛细胞生长发育信号分子的功能。既往已有研究证明，β细胞功能衰竭很可能是胰岛微血管病变的表现[2]，而过量的IMEC凋亡是引起胰岛微血管病变的重要因素。正常的情况下，血管内皮细胞的凋亡与生成处于一个动态平衡的状态，但长期处于一种慢性的低度亚临床炎症状态的2型糖尿病患者，尤其发生酮症酸中毒、急性感染时，短时间内启动炎症级联反应，导致胰岛微血管内皮细胞大量凋亡，从而破坏动态平衡，抑制了血管的生成，最终导致β细胞损伤。据此，深入研究胰岛内皮细胞病理生理改变的机制，建立有效阻断损伤通路的途径，对于保护胰岛细胞，阻止糖尿病的发生发展具有积极意义。 为了更好地观测炎症起始细胞因子TNF-α、放线菌素D/TNF-α对IMEC的影响，以及IMEC上TNFR1的表达和阻断凋亡通路的机制，本试验在建立小鼠IMEC凋亡模型的基础上，以小鼠IMEC为研究对象，探讨炎症因子与胰岛微血管内皮细胞凋亡的关系，以期为防治糖尿病提供新的实验依据。 目的: 研究肿瘤坏死因子1型受体（TNFR1）在小鼠IMEC上的表达，观察TNF-α，ActD/TNF-α刺激对IMEC的作用及其可能的损伤机制，建立小鼠IMEC的凋亡模型，为干预糖尿病及寻找新的治疗靶点提供实验依据。 方法: 1.以美国国立细胞库（American Type Culture Collection，ATCC）MS-1细胞作为试验对象进行培养和诱导凋亡。将MS-1细胞置于含5%新生牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。细胞贴壁生长，铺满后以0.25%胰酶消化传代，每3d传代1次。 2.细胞爬片及免疫荧光染色：细胞经消化后，用含5%新生牛血清的培养基将细胞调成的细胞悬液，接种于6孔板中，待细胞生长状态良好时终止培养。4%多聚甲醛固定爬片30 min后PBS冲洗，用0.1%Triton X-100处理后以正常羊血清工作液封闭，倾去血清，滴加一抗即兔抗鼠TNFR1多克隆抗体，过夜后滴加二抗即FITC标记羊抗兔IgG，室温孵育2h。封片后在荧光显微镜下观察、拍照。 3.透射电镜观察：将细胞随机分为3组：①正常对照组、②TNF-α组（TNF-α终浓度为100ng/ml，以下括号内浓度均指终浓度）、③ActD/TNF-α组（在20ng/mlActD预处理15min后再加入TNF-α）。细胞经药物作用24h后，再用胰酶消化、PBS洗涤、离心、弃上清后以4%、PH7.4的戊二醛固定，双铅染色后置透射电镜下观察细胞的形态学变化。 4.细胞毒实验分为两部分：将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，每组6个复孔。用不同浓度的TNF-α（每孔加100μl）37℃、5%CO2孵箱中刺激24小时后，每孔加MTT溶液（5g/l）20μl，37℃孵育4h，吸除培养基，每孔加入150μl二甲亚枫（DMSO）振荡10min，选择570nm波长测吸光度以判断细胞活力。同时，设不加细胞只加培养液的空白对照孔，比色时以空白孔调零。MTT自动比色法所测的吸光度反映细胞的损伤情况。 4.1 TNF-α体外对IMEC生长的细胞毒性作用 用不同浓度的TNF-α作用于对MS-1并观察其对MS-1生长的影响。实验分组：control组为正常对照组，细胞未经任何处理；TNF-α组加入不同浓度的TNF-α（20，40，80，100ng/ml）；ActD/TNF-α组在20ng/ml ActD预处理后加入与上组相对应的浓度的TNF-α；作用24小时后，用MTT法检测细胞毒作用， 4.2 Ac-DEVD-CHO拮抗ActD/TNF-α对IMEC的细胞毒作用 用MTT法检测Ac-DEVD-CHO对ActD/TNF-α的拮抗作用。实验分组：A组为正常对照组，细胞未经任何处理；B组为仅加TNF-α（100ng/ml）；C组为ActD（20ng/ml）预处理后加入TNF-α（100ng/ml）；D组为加入Ac-DEVD-CHO（200μmol/L）后15min加入ActD/TNF-α，孵育24h后，用MTT法检测细胞毒作用。 5.流式细胞仪检测细胞凋亡：将细胞接种于6孔板后，试验分组：TNF-α组为仅加入TNF-α（100ng