疾病诊断新方法-案例实例.ppt

疾病诊断新方法;DNA为基础的疾病诊断新方法 飞速进展的原因;分子生物学新技术;; (1)基因检测必须要有针对目标----特定基因 (2)直接检测特定基因的突变----位点、性质 (3)基因示踪----连锁分析;受检材料的选择：DNA，RNA或蛋白质;RNA优于DNA，但更难于获得与操作 1、目的基因易于获得组织中表达 2、较大基因未知突变筛查 3、RT-PCR和DNA测序相结合可检出DNA水平的突变，而且能可靠地检测出hn-RNA加工过程的异常剪接。 RNA检测时要注意的一些问题：①避免mRNA的降解②目的基因的表达组织③许多突变导致mRNA不稳定，因此杂和个体的RT-PCR产物可能只显示正常等位基因 。; 蛋白质表达分析---检测特异蛋白质 免疫印迹（Western blot）免疫组织化学 免疫荧光技术;二、基因检测基本原理及常用技术;探针标记;;Nick Translation;随机引物标记探针;Southern Blot;DNA 样品;(3)Northern 印迹杂交;;;步骤：;PCR;PCR扩增;三、筛查致病基因突变;未知点突变检测 缺失（重复）检测 PCR----SSCP 1、多重PCR PCR----DGGE 2、MAPH PCR----DHPLC 3、MLPA 4. Sequencing 5. DNA 芯片技术 ;（1）PCR-SSCP;PCR-SSCP过程：;; ;（3）PCR-DGGE;;;垂直DGGE结果;6%DGGE检测家系成员PAH基因外显子6的电泳图;(3)PCR-DHPLC;DNA部分变性条件下检测DNA变异的原理： 变异型和野生型DNA可形成同源和异源双链． 其在色谱柱上保留时间存在差异， 异源双链因存在错配区而更易变性，在色谱柱保留时间短于同源双链而先被洗脱下来， 从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，据此可以分辨出变异型DNA.;在经历95 ℃变性再缓慢复性后,存在多态或突变位点的靶序列PCR 产物会杂交形成杂合双链( heteroduplex) 和纯合双链(homoduplex) 混合物 ;; DHPLC的特点： 灵敏，准确； 分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟； 容易实现自动化操作； 适用于较大样本中基因突变的筛查 检测变异的PCR产物长度范围最好在200～500 bp ;DHPLC可应用于：;（4）DNA测序;DNA自动测序;（5）DNA芯片技术;基因芯片;检测缺失和重复; ⑵多重可扩增探针杂交(MAPH);多重可扩增探针杂交 (multiplex amplifiabl probe hybridization ,MAPH)的原理; (3) 多重连接探针扩增（muotiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)的原理 MLPA是基于MAPH技术基础上发展起来的，是一种灵敏度很高的相对定量技术，利用简单的杂和（hybridization）、连接（ligation）及PCR扩增（PCR amplication）反应，在单一反应管内同时检测最多40个不同片断的拷贝数的变化。; MLPA的原理 ; MLPA和MAPH技术的应用: 遗传疾病基因缺失、重复(如SMA、DMD基因等)、基因甲基化检测(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS))、 抑癌基因诊断(如Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。 如染色体数目异常(Trisomy13、18 21)、 至今已发展出的检测探针种类，已超过上百种。;;134患儿外显子51，52，53，54缺失，135为患者母亲，为外显子51，52，53，54缺失携带者，137为正常女性对照，140为正常男性对照。;四、检测特定序列变化----已知突变检测;(1)限制性酶切图谱分析法---检测已知突变; ;;例2 HbS;;;(2)ASO探针杂交法---检测已知点突变;斑点杂交结果:;;（4）三核苷酸重复疾病的遗传检测;五、基因示踪;DNA 多态的概念及类型;1.RFLP(Restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性);;2.VNTR(Variable number tandem repeat,数