内分泌与代谢病学专业优秀论文 乙醇对人肝l02细胞糖原和gsk-3β、p-ampk的影响.doc

内分泌与代谢病学专业优秀论文 乙醇对人肝L02细胞糖原和GSK-3β、P-AMPK的影响 关键词：乙醇 人肝L02细胞 糖原代谢 糖原合成酶激酶-3β 腺苷酸激活蛋白激酶 摘要：背景： 饮酒过量已成为严重社会问题，乙醇是现代社会滥用最广的成瘾物质。流行病学调查显示，过量摄入乙醇可对机体产生多方面不利影响，如酒精性肝炎、脂肪肝等，并可影响糖、脂肪、蛋白质等物质的体内代谢。正常血糖水平对维持机体能量代谢有着重要作用，而乙醇摄入对糖代谢的影响已引起广泛关注。资料显示，急性乙醇中毒可导致严重低血糖，但在一定条件下，乙醇又可导致高血糖，并认为这主要取决于体内糖原储备是否充足。研究乙醇对糖原代谢的影响具有重要意义。 糖原合成与分解是肝脏生化功能的重要方面，它不仅为自身的生理活动提供能量，也为其他器官的能量需要提供葡萄糖，血糖水平下降引起机体储备的糖原分解和糖异生作用增强。糖原合酶（glycogen synthase，GS）是糖原合成过程的关键酶，其活性受到磷酸化形式的调节。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）则可在体内磷酸化糖原合酶，使其失活，负调控糖原合成。GSK-3为丝/苏氨酸蛋白激酶，有两个同功异构体，分别是GSK-3α、GSK-3β。GSK-3本身亦可被磷酸化（GSK-3α的Ser21或GSK-3β的Ser9）而失活，使得糖原合酶的磷酸化受到抑制，从而促进糖原合成。测定GSK-3的水平，能反映出活性GS的表达状况。目前研究较多集中于GSK-3β。有研究认为，乙醇摄入后可减少大鼠肝脏糖原含量，降低大鼠肝脏糖原合酶的活性及表达，但并未报道对GSK-3β的影响，亦未见关于乙醇对人类肝细胞GSK-3β影响的报道。 腺苷酸激活的蛋白激酶（AMP—activated protein kinase，AMPK）为外周组织细胞内的能量感受器，近年来被认为与糖代谢过程关系密切，它有α、β、γ三个亚单位，细胞内AMP/ATP比值升高可激活AMPK，其中α亚单位Thr172的磷酸化（P-AMPK）对AMPK激活，发挥其激酶活性至关重要。每克乙醇本身可提供热量7.1kcal/g，干扰机体能量代谢。目前有研究报道，乙醇作用后，小鼠的AMPK活性可增强或降低，而对于乙醇对人类肝细胞反应能量代谢的AMPK的影响以及AMPK对GSK—3的变化又有何影响目前仍是未知领域。 乙醇对糖原代谢过程的研究较少，而对人类肝细胞糖原代谢的影响更是罕见报道。本研究选取正常人类肝L02细胞作为研究对象，观察乙醇直接作用后，人肝L02细胞内糖原含量变化，并进一步研究乙醇对糖原合成代谢过程中的关键酶GSK—3β的影响、P—AMPK的表达变化，初步探讨P—AMPK对GSK—3β的影响。 目的： 1、研究乙醇对体外培养的人肝L02细胞糖原含量及GSK-3β、P-AMPK的影响。 2、通过加入AMPK的激动剂（5—Aminoimidazole—4—carboxamide—1—b—D—ribofur—anoside，AICAR）与阻断剂（6—[4—（2—piperidin—1—yl—ethoxy）—phenyl]—3—pyridin—4—yl—pyyrazolo[1，5—a] pyrimidine，Compound C），间接观察P—AMPK对GSK—3β的影响。 方法： 人肝L02细胞于37℃、5% CO2条件下在改良RPMI1640中培养，0.25%胰酶消化传代，每2—3 d换液。在处于对数生长期的细胞中加入乙醇，并按加入乙醇浓度的不同分为0 mmol/L组、50 mmol/L组、100 mmol/L组，0mmol/L组细胞正常换液，培养24 h后，收集细胞；采用蒽酮—硫酸比色法测定细胞糖原浓度，同时提取细胞DNA并测定浓度；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测GSK-3β及P-AMPK表达水平；并用AICAR（0.5 mmol/L）和Compound C（10μmol/L）预处理0mmol/L组和100 mmol/L组细胞1h，再与乙醇共同作用24 h，检测GSK—3β蛋白表达。结果采用SPSS11.5进行统计分析。 结果： 1、50 mmol/L组和100 mmol/L组分别与0mmol/L组相比较： （1）L02细胞内糖原含量分别下降41.3%（Pamp;lt;0.01）和52.8%（Pamp;lt;0.01）； （2）GSK-3β表达相对水平分别增加15.2%（P=0.011）和20.1%（P=0.002）； （3）P-AMPK表达相对水平分别增加8.99%（P=0.002）和10.3%（P=0.001）； （4）50 mmol/L和100 mmol/L两组比较