第2章 DNA重组(限制性内切酶与DNA片段化)讲解材料.ppt

第二章 DNA重组;1.天然DNA的种类;天然DNA的提取;2.限制性内切酶和DNA片段化;限制性内切酶;;2.1 寄主控制的限制与修饰现象;限制——修饰现象;产生这种现象的原因何在;限制——修饰体系;;2.2 分类;限制性核酸内切酶的类型;2.3 命名;2.4 基本特性;2.5 内切酶识别序列的特征;序列长度：多数为6bp; 6 Not I GCGGCCGC 8 BbvCI CCTCAGC 7 PpuMI RGGWCCY 7;结构;二重旋转对称;;5’…G-C-T-G-OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3 ’…C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’;5’…G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …3’ 3’…C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C …5’;非对称;识别序列出现频率 ;稀切酶（rare cutting enzymes）;同裂酶(isoschizomer);同尾酶（isocaudamer）;2.6 切割位点;偏爱位点 P42;2.7 反应系统;大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：;1） DNA纯度：要求较纯 因素： 蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子 措施： 增加酶的用量；扩大反应系统体积 延长反应时间 ；添加亚精胺;2) DNA的甲基化程度;3） DNA分子构型 效率：线性DNA分子 大于 超螺旋质粒DNA 环状病毒DNA;4）识别序列的侧面序列 限制酶切割DNA，对识别序列两侧的非识别序列有长度要求，只含识别序列的寡核苷酸是不会被酶切的，故通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸;试剂公司提供的包装说明书 会标明酶活性单位数和容积活性，最佳作用条件;2 酶活单位;常规缓冲液 pH， Mg++， DTT/β-ME， (10X) pH 7.0-7.9 (at 25℃) Tris-HCl， 乙酸 离子强度： NaCl 高 中 低 100mM 50mM 0 ③ Mg++ 10mM MgCl2 ， MgAc; 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃ 一部分为50-65℃ 少数25-30℃ 高温作用酶于37℃时活性多数10-50% TaqI (65℃) 10% ， ApoI(50℃)50% ;2.8 star activity;2、抑制star activity的措施 ① 减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度 ② 保证反应体系中无有机溶济或乙醇 ③ 提高离子强度到100～150mM (如果不会???制的话) ④ 降低反应pH至pH7.0 ⑤ 使用Mg++作为二价阳离子 ;2.9 DNA分子片段化;2.9.1 单酶切法;2.9.2 双酶切法;重组克隆载体pMD18-T-RIP双酶切电泳图 M: λDNA/ HindⅢ+ EcoRⅠ 1: BamHI和SacI双酶切后的重组克隆载体18-T-RIP;2.9.3、部分酶切;缺点：影响需要的DNA片段的得率 优点：根据重组设计的需要，专门创造部分酶切的条件，获取需要的DNA片段;限制性内切酶反应的终止;1、限制酶十分昂贵！ 2、限制酶在50%甘油中保存于-20 ℃最稳定 3、尽量减少反应中的加水量 4、延长消化时间可使所需酶量减少