第7章蛋白质分离纯化与表征培训课件方案研究.ppt

第7章 蛋白质的分离纯化和表征;一种蛋白质的混合物在pH6的DEAE-纤维素柱中被分离，用pH6稀盐缓冲液可以洗脱C，用pH6的高盐缓冲液，B和A依次被洗脱，用凝胶过滤测定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS只发现一条带。请分析实验结果 ;蛋白质分离纯化是利用其特性的差异; 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大; 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 ;测定蛋白质相对分子质量的原理和方法;（一）根据化学组成测定最小分子量;;蛋白质混合样;LogM;（四）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （最常用）;;SDS（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。 目前测定亚基分子量的最好办法。;SDS;;;三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。;蛋白质胶体性质的应用;;（二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀 I 可逆沉淀 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。; 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等;1.?盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋白质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。如：微生物发酵酶制剂;等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？;2.?有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理： 破坏蛋白质的水化膜以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。;3.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀） 用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷，蛋白质分子带有相同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集沉淀。;酸;4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜) 当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 ;5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。 能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症，啤酒澄清”;6.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋 酶的制备：超氧化物歧化酶的提取;四、蛋白质分离纯化的一般原则;五、蛋白质的分离纯化方法;血液透析;2、密度梯度（区带）离心;3、凝胶过滤;（二）利用溶解度差别的纯化方法;（三)根据电荷不同的分离方法;平板电泳;等电聚焦电泳;双向电泳;离子交换层析;（四）利用蛋白质选择性吸附的性质;（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法;;（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析;六、蛋白质含量测定和纯度鉴定;（二）蛋白质纯度鉴定;凝胶过滤和SDS均是利用凝胶，按照分子大小分离蛋白质的，为什么凝胶过滤时，蛋白质分子越小，洗脱速度越慢，而在SDS中，蛋白质分子越小，迁移速度越快