第一章 基因工程的分子生物学基础知识讲稿.ppt

3 从细胞提取物中纯化DNA 降解杂质,留下DNA(苯酚与氯仿的混合物,RNA酶) 离子交换层析,分离DNA(带正电荷的离子交换剂) 4 DNA取样的浓缩 乙醇沉淀(破坏了DNA分子间的氢键) 5 DNA浓度的测量 A260/A280=1.8 实例1：细菌DNA的提取 植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到1.5ml离心管 加650μl 在65度预热的CTBA提取液 水浴锅中65温浴40分钟后取出，静置冷却 加入650μl苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，静置5分钟 12000rpm 离心10 分钟 实例2：植物DNA的提取 取上清液，加入2μl（10mg/ml）Rnase,37 度水浴30分钟 再抽提一次 取上清液，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇 轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或6000rpm离心5分钟 70%的乙醇洗后，凉干。 实例2：植物DNA的提取 实例3 质粒DNA的制备 1 基于分子大小的分离 2 基于构象的分离 质粒有三种构型 cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。 ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。 线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。 超螺旋 DNA 松弛cccDNA 开环DNA 核酸内切酶 DNA连接酶 核酸内切酶 DNA促旋酶 拓扑异构酶 碱变性 用CsCl-EB等密度离心 Upper band containing chromosomal DNA and open plasmid circles Lower band of covalently closed circles plasmid DNA Ethidium bromide (EB) 包含质粒的细胞 用溶菌酶弱化细胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解 变性的染色体 DNA 用acidic sodium acetate 中和 染色体DNA复性 形成不溶的网状物 高浓度的acidic sodium acetate使 protein-SDS 复合物和高分子量的RNA 沉淀 ccc DNA不发生变性，以天然状态溶解在溶液中 通过离心去除沉淀 通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒DNA。 二、凝胶电泳 根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。 DNA和RNA在胶上的迁移性 DNA或RNA分子带有负电荷，在胶支持物上向正电极运动 线性DNA分子根据大小进行分离，小分子比大分子要泳动快，所以能将DNA分子进行分离 环状DNA分子的移动受拓扑结构的影响。相同分子量的情况下，超螺旋线性缺刻或松散 二、凝胶电泳 琼脂糖凝胶 是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定 凝胶孔径的大小 随着浓度的增加而变小，有效分离DNA大小范围为0.2~10Kb DNA相对分子质量标准物 水平型平板电泳槽 二、凝胶电泳 聚丙烯胺凝胶 （acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 凝胶孔径的大小决定于两者的总浓度以及比值 分辨率比较高，能区分1～2bp 差别的DNA/RNA分子，但只能分离几百bp的DNA/RNA分子 三、 DNA测序 链终止法测序 化学降解法测序（自习） 自动化测序 非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等） 1、链终止法测序—技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA A 高酶活性 B 无5’→3′外切酶活性 C 无3′→5′外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基 第一章 基因工程的分子生物学基础 授 课 人：余春梅 授课学院: 南通大学生命科学学院 基因工程的概念 细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 遗传工程、基因操作、重组DNA技术等 基因工程诞生的理论基础