第七章 植物基因工程讲解材料.ppt

第七章 植物基因工程;转基因植物 ;世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。 ;转基因番茄?? ??1994年，美国研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。 ;转基因甜椒 ; 转基因油菜 ???? 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。 ;??? 玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。 ;转基因牵牛花 ;本章主要内容： 第一节 植物基因工程的发展现状 第二节 植物基因工程方法 第三节 转化子细胞的筛选 第四节 转化体的鉴定与证明 第五节 植物基因工程研究的应用和展望; 植物基因工程的概念; 转基因植物的应用前景和理论意义; 国际转基因作物发展现状; 国内转基因作物发展现状;第二节 植物基因工程方法; 一、原生质体介导法; PEG介导的基因转化; 脂质体介导基因转化; 电激法介导基因转化; 显微注射介导的基因转化; 激光微束介导的基因转化;二、 基因枪法（微弹轰击法）;操作步骤;转化率影响因素 ;三、根癌杆菌介导法; Ti质粒的改造策略 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍： （1） 质粒过大，操作困难 （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 （3）植物激素类的影响 （4） Ti质粒中存在不起作用的序列 （5） Ti质粒的局限性;为了使Ti质粒变成操作简便、转化有效的外源基 因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植 物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采 取不同的改造策略. 二元载体较一元载体的优点: 构建比较方便; 二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.;根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理 六个步骤： （1）农杆菌对受体 （2）农杆菌附着到植物受体细胞 （3）诱导启动毒性区基因表达 （4）类似接合孔复合体的合成和装配 （5）T-DNA的加工和转运 （6）T-DNA的整合;基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较 ;第三节 转化子细胞的筛选; 转化筛选细胞的方法主要有两种： 　一、根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖； 　二、受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。;一、植物基因工程中的选择基因;1、新霉素抗性基因（neor） 新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。;2. 庆大霉素抗性基因（gent r）;3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt） 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。 4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar） 该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。 ;二、报告基因;理想报告基因的基本要求： 1、受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。 目前最常用的报告基因有：? -葡萄糖苷酸酶基 因（gus）;氯霉素乙酰转移酶基因；荧光素酶基 因;分泌型碱性磷酸酶 ;荧光蛋白家族 ; ? -葡萄糖苷酸酶基因（gus）;氯霉素乙酰转移酶基因;CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期相对较短，适于检测其瞬时表达。 可用同位素标记法、荧光法和自动ELISA法检测其活性，也可进行Western blots和免疫组织化学分析。CAT与其它报道基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。 ;荧光素酶;荧光素酶基因;荧光蛋白家族;? 这些常用的报道基因也可被联合应用，可同时检测2个甚至3个基因的表达。报道基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范