第十二章 基因工程育种知识讲稿.ppt

第十二章 基因工程育种;第一节 概述;基因工程(gene engineering)常和以下名称混用;一、基因工程在微生物育种中的应用;二、基因工程原理和步骤;主要步骤包括：;（一）第四次工业大革命： ;（二）第二次农业大革命 ;全球商业化转基因作物的概况;（三） 第二次医学大革命：;医学方面的应用前景;基因工程药物的高回报;四、基因工程的负面影响;第二节 基因工程载体;一、质粒载体 （一）质粒载体的选择标记 四环素(tetr)；氨苄青霉素(ampr)；氯霉素(catr)；卡那霉素（kanr）。;（二）质粒载体的发展;可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体 如pUC质粒，可以编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。 2. 带有单链噬菌体复制起点的质粒载体 如M13噬菌体。 3. 带有噬菌体启动子的质粒载体 4. 可对重组体进行正选择的质粒载体 如编码tetr的质粒载体。;（三）常用质粒载体;二、λ噬菌体载体;第三节 基因工程所用的酶;二、DNA聚合酶;三、依赖于DNA的RNA聚合酶 1. SP6噬菌体RNA聚合酶 2. T3和T7噬菌体RNA聚合酶 四、连接酶、激酶及磷酸酶 五、核酸酶 1. BAL31核酸酶 2. S1核酸酶 3. 核糖核酸酶A 4. 核糖核酸酶T1 5. 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 6. 外切核酸酶Ⅲ 7. λ噬菌体外切核酸酶;第四节 基因工程的主要步骤;二、目的基因的产生与分离;（一） PCR;模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。;（1）变性：加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸：温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。;PCR反应的基本原理;（三）逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。 ;1、mRNA的纯化： 可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。 2、互补DNA第一链的合成 mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。;3、互补DNA第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA??一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。 4、互补DNA克隆 根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。;（三）从基因所在的生物体直接取得;（四）化学合成法 ;由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列; 人工化学合成的限制;三、外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点的连接;2. 平端连接 适用于：（1）限制性内切酶切割产生的平端 （2）粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。;Eco RⅠ;1. 受体菌条件 （1）安全宿主菌 （2）限制酶和重组酶缺陷 （3）处于感受态(competent) ;2. 导入方式;五、重组体的筛选 　1. 直接选择法 　(1) 小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析 　(2) 插入失活法 　(3) α互补法 　(4) 菌落原位杂交法 2. 免疫学方法 　如免疫化学方法及酶免检测分析等;　(1) 小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析;(插入失活法) （2）、抗药性标记选择;（3） α 互补的检测 ;原位杂交;重组DNA技术操作的主要步骤;表达体系的建立 1. 表达载体的构建 2. 受体细胞的建立 3. 表达产物的分离纯化;1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 标准：选择标志→强启动子 翻译调控序列→多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： A. 不宜表达真核基因组DNA B. 不能加工表达的真核蛋白质 C. 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 D. 很难表达大量可溶性蛋白;优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累