第十五章 DNA重组技术的基本原理培训课件方案研究.ppt

第十五章 DNA重组技术的基本原理;第一节 DNA重组的技术要件;DNA重组的 技术路线;一、重要的工具酶及其作用特点;（二）DNA连接酶;（三）DNA聚合酶;（五）RNA聚合酶;二、目的基因的载体类型及其功能;（一）质粒及其功能;;（二）噬菌体及其功能;（三）考斯质粒;（四）动物病毒的载体作用;　　;诱导植物产生瘤细胞;第二节 DNA重组的基本技术步骤;Foreign DNA to be inserted;一、目的基因的制备方法基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。　　为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为目的基因。;（一）建立DNA文库;基因组文库建立顺序;基因文库和cDNA文库的建立;（三）人工合成DNA片段;（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA;PCR技术原理示意图;二、目的DNA和载体的体外连接;三、将重组的DNA复合物导入受体细胞;　（一）重组DNA分子转化　　 大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。 转化（transformation） ： 携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。 ;转化;（二）噬菌体重组体的转染 　　转染：通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。 　　含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。;四、重组克隆的筛选方法;（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采用斑点杂交或DNA印迹(southern blotting)等方法进行鉴定。 （1）斑点杂交法 　　提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在分子杂交的膜上，用含目的基因DNA片段的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子。 ;（2）southern杂交法 斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染色体基因组上还是其他基因组上。而southern杂交（DNA印迹）则可对它进行定位。 ;（三）免疫学方法鉴定克隆;第三节DNA重组技术的应用前景;基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素;二、植物基因工程 　　转化基因植物是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。 　　许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化和基因枪转化。;;转移有人类生长 激素转基因鼠;四、遗传疾病诊断与基因治疗 　　利用基因诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从 DNA即基因水平进行诊断 ， 准确度高，速度快。 　　如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。;　　特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中使疾病得到纠正或治愈，通常叫做基因治疗(gene therapy)。 　　方法：减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA) ?构建重组DNA分子?用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞 ?将正常基因整合到染色体上。;　2000年法国Fischer用基因工程方法治愈患有SCID（严重联合免疫缺陷）遗传病的两个婴儿(8个月和11个月) 。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。