基于微孔板的高通量筛选羟基烟酸转化菌方法的建立.doc

基于微孔板的高通量筛选6-羟基烟酸转化菌方法的建立 微生物ActaMicrobioligicaSinica 48(1):112-115;4January2008 ISSN0001—6209;CN11-1995/Q http: 基于微孔板的高通量筛选6.羟基烟酸转化菌方法的建立 杨瑶,袁生,戴亦军,尚广东 (南京师范大学生命科学学院,南京市微生物技术工程研究中心,南京师范大学生命科学学院微生物工程 重点实验室,南京210046) 摘要:建立了一种基于96孔板.酶标仪的双波长紫外分光光度法高通量筛选6一羟基烟酸转化菌的 方法.实验以251nm为测定波长,231nm为参比波长测定转化样品的6.羟基烟酸含量,6.羟基烟 酸与△A25l-23l在0.5～11~tg/mL浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯.比尔定律,平均回收率为 99.11%～100.81%.利用96孔板.酶标仪,每天筛选量可达到2000～5000个反应,达到高通量筛选 要求. 关键词:微孔板;高通量筛选;双波长紫外分光光度测定;烟酸;6一羟基烟酸 中图分类号:Q786文献标识码:A文章编号:0001.6209(2008)01.0112.04 生物转化是指利用生物体代谢过程中产生的酶 对有机化合物某一特定部位(基团)的作用,使它转变 成结构上相类似的另一种化合物.在微生物酶系催化 下进行的生物转化称作微生物转化(microbiallrans. formation)t.筛选体系(包括转化菌株的筛选,转化 产物和底物的筛选等)的建立是微生物转化研究中 最迫切解决的问题,没有有效的筛选方法将大大降 低研究效率,同时耗费人力及物力资源.因此,以微 生物转化烟酸生成6.羟基烟酸的研究为例,建立了 基于96孔板.酶标仪的高通量筛选6.羟基烟酸转 化菌的方法,对其他转化菌的大规模筛选有参考 价值. 随着烟碱类杀虫剂的迅速发展,6.羟基烟酸作 为合成该类杀虫剂重要的中间体『2卅开发前景的广 阔,微生物转化生产6.羟基烟酸已成为国外研究热 点】,本实验室在高产菌株筛选,发酵产酶条件优 化等方面已开展研究m,如今迫切需要建立高通 量筛选6.羟基烟酸转化菌的方法以提高工作效率. 此外.烟酸羟基化相关基因的克隆也正在进行,已 构建了6.羟基烟酸产生菌睾酮丛毛单胞菌Coma. monastestosteroniJA1基因组文库,希望通过高通 量筛选转化子获得能够转化烟酸生成6.羟基烟酸的 阳性克隆,进而得到烟酸脱氢酶的基因的相关及全 基因序列.有效的高通量筛选阳性克隆的方法也是 该研究成功的关键. 目前,在烟酸微生物转化的研究中,6.羟基烟酸 的生成都是由高效液相色谱HPLC检测的l¨】,该 方法准确,灵敏度高,但样品要经过色谱柱的分离, 因此分析时间长,无法达到高通量筛选的要求.利 用96孔板.酶标仪对烟酸和6.羟基烟酸的紫外吸收 波谱进行分析,选取合适的波长对可吸收曲线部分 重叠的转化样品进行6.羟基烟酸生成量的测定及双 波长紫光分光光度法,结果满意,由于样品无须分 离,分析时间大大缩短,每天可检测2000～5000个 反应,完全达到高通量筛选要求,解决了基因文库 的筛选中大量突变体筛选的难题,对于类似具有转 化产物和底物光吸收波长改变的研究工作建立高通 量的筛选方法也具有一定的参考价值. 基金项目:国家十五科技攻关项目(2004BA308A22—12);江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJA21016);江苏省六大人才 高峰项目(06一C一014) 通讯作者Tel/Fax:+86—25E—mail:yuansheng@~.ca 作者简介:杨~r(1981一),女,南京人,博士研究生,主要从事微生物转化研究.E—mail:cranny_yang@ 收稿日期:2007—05—08;修回日期:2007—07—19 杨瑶等:基于微孔板的高通量筛选6一羟基烟酸转化菌方法的建立.,微生物(2008)48(1)113 1材料和方法 1.1主要试剂和仪器 紫外一可见连续波长酶标仪MultiskanSpectrum (Thermoelectroncorporation);标准品:6一羟基烟酸 为Acros(Belgium)产品,烟酸及其余试剂均为国产 分析纯. 标准溶液的配制:用磷酸缓冲液(0.02mol/L,pH 值7.0)准确配制251.tg/mL的6一羟基烟酸标准溶液和 251.tg/mL的烟酸标准溶液. 1.2实验方法 分别取251.tg/mL的6一羟基烟酸标准溶液0.1, 0.2,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,10.0,11.0,12.0, 13.0,15.0mL于6个25mL容量瓶中,用磷酸盐缓 冲液定容至刻度,以251nm为测定波长,231nm为 参比波长