RNA提取-反转录-半定量PCR.docx

RNA提取原理及每个步骤的原理实验目的：提取组织中RNA，作为逆转录cDNA的原料实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）?TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75％乙醇（用Rnase-free水配制）实验步骤：（TIANGEN：Phase lock GelTM Henny配合Trizol A+提总RNA操作）匀浆处理 （*打开离心机，降温）-80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10％（注：先加700μl Trizol A+，再加300μl，防止外溢；一般匀浆1.5~2min，可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中将Phase lock GelTM (PLG)置于离心机中，15000Xg离心30s离心到底部，不让贴壁将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。将样品室温放置2~3min使分层更彻底4℃，12000Xg离心15min，PLG会在有机相和水相之间形成致密的固相层PLG锁住可能污染核酸的杂质将PLG上层含RNA的水相转移至另一Rnase Free的离心管转移RNA向得到的水性溶液中加等体积的异丙醇，彻底混匀，室温放置30min沉淀还原RNA4℃，12000Xg离心10min，去上清从混合液中分离RNA加入1ml 75％乙醇（用Rnase Free-ddH20配制），对沉淀进行洗涤洗涤RNA沉淀4℃，7500Xg离心5min，倒出液体，不要将沉淀倒出从混合液中分离RNA室温放置晾干，每100ml组织+30μl Rnase Free-ddH20，混匀，充分溶解溶解RNA溶解RNA分装到小PCR管中，10μl ，10μl，20μl，25μl（稀释30倍），用于测RNA含量。（如果RNA沉淀在1mm左右，可以加30μl ddH2O，如果3mm左右，可加70μl ddH2O；本次根据其大小加了35μl ddH2O，10μl+10μl+10μl+5μl 小PCR管测定RNA纯度紫外分光光度计测RNA含量取2.5μl样液+72.5μl Rnase Free-ddH20稀释30倍混匀260：核酸最高吸收峰260/280=1.66 280：蛋白最高吸收峰RNA的260/280应2.0，偏小则说明蛋白质量较高测定RNA纯度跑胶（见下次）测定RNA纯度附录：A280核酸 A320 背景（溶液浑浊度）A230 盐浓度 A260 蛋白等有机物 A260/280=1.8~2.0 RNA 质量较好，RNA中蛋白质或其他有机物的污染可以容忍260/2801.8.溶液中蛋白质或其他有机物的污染较明显260/2802.2. RNA已水解为单核苷酸Trizol A+可保持RNA的完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物加入氯仿后，溶液分为水相（含RNA）、有机相（蛋白）、中间层（DNA） Phase lock GelTM (PLG)：可在水相和有机相之间形成致密固体RNA质量和浓度鉴定1、RNA跑电泳RNA电泳的理想带型是：1.完整的RNA琼脂电泳会有三条带，某些试剂盒可能只有两条（没有最下面的5S条带）2.上面两条带最亮，分别代表28S和18S rRNA。且第一条带（28S）应该为第二条带（18S）的亮度约两倍。最下面一条带最淡，为5S条带。3.如果你发现最下面一条带很亮而上面两条带很淡甚至没有，那就说明你的RNA发生了严重的降解。只能重新提取了。4.但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。5.一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（条带的边缘清晰），我们认为RNA是好的。6.电泳的目的在于检测28S和18S