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T细胞分离方法的研究进展 　　摘要：T细胞是参与机体免疫应答的关键成员，其功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点。T细胞分为多个亚类，分别通过不同的作用机制参与机体的免疫应答。在T淋巴细胞的表型特征及其功能的研究中，T细胞的分离和纯化显得尤为重要。目前应用较多的分离方法主要有E玫瑰花环形成分离法、尼龙毛柱分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪分离法等，文章就这几个方法做一综述。 　　关键词：T细胞；E-玫瑰花环；尼龙毛柱；免疫磁珠；流式细胞术 　　中图分类号：Q819 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0062-2 　　T细胞是介导特异性免疫的核心细胞，对其功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点和前沿，对T细胞的分离纯化可满足深入研究其生物学特性、功能及其表面抗原表位、受体作用的要求。根据T细胞表面不同的标志（主要是表面抗原和表面???体），目前人们已建立多种分离方法并在实际研究中广泛加以应用。 　　 　　1 E-玫瑰花环形成分离法 　　 　　玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种试验方法。玫瑰花结是1970年Coombs等人在研究淋巴细胞表面抗原或抗原抗体复合物的受体时发现的，他们观察到在自然情况下，人体淋巴细胞能与绵羊红细胞粘附而形成玫瑰花样细胞，因涂片瑞氏染色后，淋巴细胞被染成蓝紫色犹如花芯，而粘附于淋巴细胞周围的绵羊红细胞被染成红色类似花瓣，整个形状如上衣上的装饰品――玫瑰花别针，故称此种细胞为玫瑰花结。1973年国际免疫学会已公认这是T细胞的特征标志之一。 　　原理是动物外周血液中有T细胞和B细胞。T细胞表面具有红细胞受体，同种或异种动物红细胞与之相遇后、结合，并围绕于T细胞周围排列成为玫瑰花环状。B细胞表面没有红细胞受体，则不能形成玫瑰花环。 　　E-玫瑰花环在免疫学上的意义及影响、形成的各种因素等等越来越受到学者们的重视。国内外先后报道的有马、牛、驴、鸡、猪、耗牛等[1]十多种动物的E-玫瑰花环试验，其在肿瘤、药物检测应用领域正在逐渐地增加。 　　E-玫瑰花环形成法需要绵羊红细胞，不但分离效率低，而且需低渗清除红细胞，这对淋巴细胞本身的活性就有较大的影响。另外，其他影响因素仍然较多，比如温度、淋巴细胞的浓度、红细胞是否新鲜和浓度大小、小牛血清、酶、植物血凝素及一些不定因素。 　　Bernier等[2]的报道中指出在获得纯化的T细胞方面，绵羊红细胞玫瑰花环实验给出的结果不可靠。Indiveri等[3]利用绵羊红细胞的玫瑰花环法和尼龙毛柱法分离人的T细胞并进行了对比，发现两种方法的回收率和纯度相似。Chollet等[4]利用尼龙毛柱和绵羊红细胞的玫瑰花环方法分离淋巴细胞，进行细胞电泳，结果证明，天然T细胞移动速率较快，天然B细胞移动速率较慢。 　　 　　2 尼龙毛柱分离法 　　 　　Julius等[5]最早建立了一种快速分离T细胞的方法，他们把鼠的脾细胞和淋巴结细胞悬液加到尼龙毛柱中，37℃，45min，最后获得的T细胞含量在84-91%之间，回收率在50-89%之间。 　　原理是T细胞表面较光滑，而B细胞表面绒毛较多，混合的淋巴细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，需用冷洗脱和挤压尼龙棉的方法才可获得，而多数T细胞则通过尼龙毛柱从尼龙毛上洗脱下来。 　　该方法操作简便易行，无需特殊仪器，对细胞损伤小，重复性好，适合在一般实验室应用。但有研究结果表明分离后T细胞的纯度不高，由于尼龙毛柱上可能会选择性滞留某些T细胞亚群，使其回收率较低、而且操作繁琐，要时刻注意细胞悬液的流速，过快便会造成其他淋巴细胞的混入，降低T细胞的纯度。目前国内现有条件下尼龙毛来源少，不易购得，进口的尼龙毛又非常昂贵，不易于推广，有学者尝试用脱脂棉代替尼龙毛来分离T、B淋巴细胞。 　　继Julius等的工作之后，国外一些学者[6-9]利用此方法对鸡的脾淋巴细胞、猫的外周血单核细胞、鼠脾细胞、人的扁桃体进行了分离。Antonia Corrigan等[10]对脾淋巴细胞进行了T细胞分离，发现T细胞膜上的磷脂、胆固醇、唾液酸在细胞水平上有所衰退，指出尼龙毛柱分离技术不适用于淋巴细胞的生化学检查。国内一些学者如：姜曼和谢克俭等[11-12]都用脱脂棉柱和尼龙毛柱分离纯化人外周血T细胞并进行了比较，结果两种方法分离的T细胞纯度差别不大，对纯化T细胞的活力影响较小，两者比较差异无显著性(P0.05)。 　　 　　3 免疫磁珠分离法 　　 　　免疫磁珠分离法是近年来国内外研究比较热门的一种新的免疫学技术，应用广泛。免疫磁珠最早是由John Ugelstad[13]等于1979年代制备出的一种与抗体相连的磁化聚苯