WRKY35转录因子cDNA克隆与植物表达载体构建.docVIP

WRKY35转录因子的cDNA克隆与植物表达载体的构建 　　摘要：文章以丁香假单孢菌处理的哥伦比亚型拟南芥为植物材料，利用RT-PCR 技术获得了拟南芥WRKY35转录因子的cDNA编码序列。序列分析表明，WRKY35核苷酸序列长1363bp，CDS全长1314bp，编码438个氨基酸，含有一个典型的WRKY结构域，具有WRKY 转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pBI121中，成功构建了拟南芥的WRKY35基因的植物表达载体，为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。 　　关键词：拟南芥；WRKY；转录因子；基因克隆；植物表达载体 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0039-2 　　 　　0 前言 　　植物转录因子的研究已经成为现今植物基因功能研究的一个重点。植物基因组中有相当的一部分基因是以家族形式出现，并参与因外界环境变化所导致的植物体内分子信号传递， 或诱导基因转录调控??程。在研究众多的转录因子中，WRKY转录因子是近年来研究较为广泛的植物特有的转录因子。该家族的cDNA最初从甜马铃薯、野燕麦、欧芹和拟南芥中克隆获得。这类转录因子名称来源于其蛋白含有高度保守的60 个氨基酸组成的WRKY结构域。WRKY蛋白可与含有(T)TGACC(A/T)(W盒，W-box)核心序列的DNA特异结合，并被证明能与自身启动子中的W盒结合来参与表达调控。在拟南芥中，WRKY家族共有74个成员，主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。水稻中有100余个成员，主要分布在1号和5号染色体上。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达。WRKY类转录因子被证实除参与植物的抗病反应外，还影响植物的衰老、抗胁迫能力以及生长和发育。 　　本研究以丁香假单孢菌处理的拟南芥为植物材料，通过RT-PCR 技术，获得了拟南芥的WRKY35 基因cDNA序列，对其进行测序和分析，并将此基因构建到植物表达载体pBI121上，为提高植物的抗病性奠定了基础。 　　1 材料和方法 　　1. 1 试验材料 　　1.1.1 材料 本试验所用植物材料为哥伦比亚型拟南芥，由本实验室保存。基因克隆所用大肠杆菌(E.coli)菌株为DH5α，由本实验室保存。克隆载体pEASY-T1、植物稳定表达载体pBI121由四川大学惠赠。 　　1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、AMV反转录试剂盒、等均购自TaKaRa公司。Trizol RNA提取液、U2NIQ210 柱式质粒抽提试剂盒等购自上海生工生物工程公司。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 材料处理 将拟南芥的种子进行表面消毒后，播种于MS固体培养基上，待长出2-3片真叶时，用0.5mM的水杨酸处理1h后取整个植株提RNA，-70℃保存备用。 　　1.2.2 引物的设计与合成 　　根据网址www.省略公布的WRKY35基因的cDNA序列设计合适的引物WRKY35(1-1)sense、WRKY35（1-1）antisense，目的基因扩增出来后连接到克隆载体pEASY-T1上，然后在上下游引物分别添加Xba I和SacI酶切位点WRKY35(2-1)sense、WRKY35（2-1）antisense，引物由上海华大基因有限公司合成，序列如下： 　　WRKY35(1-1)sense:5-3:ATGGACAACTTCCAAGGA 　　WRKY35（1-1）antisense:5-3CAAAGGCAAATACCGTCA 　　WRKY35(2-1)sense:5-3:GCTCTAGAGCATGGACAACTTCCAAGGA 　　WRKY35（2-1）Antisense:5-3 CCGAGCTCGGCAAAGGCAAATACCGTCA 　　1.2.3 目的基因的扩增与克隆 以反转录产物cDNA为模板，WRKY35(1-1) sense和WRKY35(1-1) Antisense为引物，进行PCR扩增。PCR反应按以下体系进行，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸120s，32个循环；72℃后延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳分离后回收纯化，回收片段连接到pEASY-T1，并转化到感受态大肠杆菌DH5α中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，PCR鉴定出的阳性克隆送上海华大基因有限公司进行测序。 　　1.2.4 序列分析 相似性比较及开放阅读框(ORF)分析用生物分析软件DNA MAN完成。 　　1.2.5 植物表达载体的构建 采用UNIQ210柱式质粒抽提试剂