抗蝰蛇毒卵黄抗体的制备及其免疫特性研究.doc

抗蝰蛇毒卵黄抗体的制备及其免疫特性研究 【摘要】目的制备一种新的抗蝰蛇毒卵黄抗体，并研究其免疫特性。方法将产卵母鸡分为低剂量（A组）和高剂量（B组）免疫组。以甲醛减毒法制备的蝰蛇毒抗原免疫母鸡；以水稀释法联合硫酸铵沉淀和超滤法分离纯化卵黄抗体；总蛋白质通过改良Lowry法测定;以ELISA法测定卵黄抗体的效价、总卵黄抗体与特异抗体含量、交叉反应。结果低、高剂量组均诱导母鸡产生有效免疫应答。高剂量组免疫效价高于低剂量组（P0.05），高剂量组于免疫后约40d抗体效价达高峰,持续约4周；而低剂量组在免疫后约50d抗体效价达高峰，持续约2周。免疫过程中，两组总卵黄蛋白无显差异(P0.05),但高剂量组卵黄中平均特异性抗体（0.29±0.04)mg/ml明显高于低剂量组（0.21±0.03)mg/ml（P0.05）.制备的抗蝰蛇毒IgY与蝰蛇毒抗原具有较高特异性，但与五步蛇（54.3%）、蝮蛇(47.5%)及竹叶青蛇(43.1%)有明显交叉反应，与眼镜蛇（11.7%）有轻度的交叉反应。结论研究证实蝰毒抗原易诱导母鸡产生良好的免疫应答，并成功制备了抗蝰蛇毒的卵黄抗体，为蛇伤防治提供新的途径。 【关键词】 蝰蛇 卵黄抗体（IgY） 鸡 免疫特性 酶联免疫吸附测定(ELISA)抗蛇毒血清主要由蛇毒免疫马匹而制得的特异性抗体,在体内能中和蛇毒,因而成为蛇伤治疗中的特效药物。然而，目前临床上使用的抗蛇毒马血清存在分离纯化过程复杂、流通不方便、相对分子质量大、价格昂贵，特别是有一定的过敏反应等缺点,从而限制了抗蛇毒血清临床应用［1］。因此，新的蛇伤治疗药物的开发和研究有着重要意义。 20世纪60年代,科学家研究发现,母鸡经抗原免疫刺激后,在输卵管内卵黄成熟期,血液中IgG被选择性地转移至卵黄中,是卵黄中惟一免疫球蛋白类，也称卵黄抗体或IgY(Immunoglobulin yolk)。研究表明，特异性IgY可应用于某些病毒、细菌和真菌所致疾病的诊断和防治。近年来,国外报道用蛇毒作为抗原免疫母鸡,从卵黄中提取特异的抗蛇毒卵黄抗体，在前期工作中，我们也初步研制了抗眼镜王蛇毒卵黄抗体［2,3］。本研究我们以减毒蝰蛇毒抗原免疫莱航母鸡，观察免疫后卵黄中卵黄抗体产生的动态规律，然后利用水稀释法联合硫酸铵沉淀和超滤法分离制备抗蝰蛇毒卵黄抗体，并对其免疫特异性进行研究，为新型抗蝰蛇毒抗体的开发提供有效依据。 1 材料与方法 1.1 材料 蝰蛇毒、饭匙倩、蝮蛇、百步蛇及眼镜蛇毒抗原由广州医学院药物中心余清声教授惠赠。蝰蛇毒按文献［4］采用甲醛脱毒法进行减毒；福氏佐剂(Freundrsquo;s adjuvant )为sigma公司产品; 四甲基联苯胺（TMB）购自广州博特生物公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgG(HRP-Goat Anti-chicken IgG)购自广州晶美公司公司； SM-3型自动酶标仪（北京圣健东方医疗仪器厂）；其它试剂均为国产分析纯。 1.2 母鸡免疫 8只健康产卵莱杭母鸡（20～22周龄，购自广州力康公司），单笼饲养，环境温度控制在(20±2)℃,相对湿度为55%～60%，噪声低于50dB，光照时间12～16h，光照强度16lx，普通饲养喂养。免疫部位、方法及方案按我们以前的方法略作修改进行［3］。将制备的蝰蛇毒抗原液与等体积完全福氏佐剂充分乳化后，经鸡双翼 、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射。分低剂量（A组）和高剂组（B组）分别进行免疫：基础免疫剂量A组为0.2mg/只，B组0.4mg/只；基础免疫后的15d、30d后改为不完全福氏佐剂进行2次加强免疫，A组加强免疫剂量分别为0.4mg、0.8mg/只，B组加强免疫剂量分别0.8mg、1.6mg/只。 各鸡从免疫前5d开始收集鸡蛋，编号后于4℃保存。 1.3 卵黄抗体的提取和纯化 按参考文献进行［3,5,6］。鸡蛋外壳经75%精酒消毒后,剪一小孔, 用卵黄分离器尽量去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，用针刺破卵膜，收集卵黄液,用双蒸水将卵黄液按1:9稀释，以0.1M稀盐酸调节pH值为5.1,搅拌均匀，4℃放置12h以上.然后以5 000g低温超速离心20min，弃去沉淀,获得卵黄水提物（WSF）；在制备的水提物中加入硫酸铵至终浓度为35%,沉淀2次；然后以100KD超滤膜进行浓缩和纯化抗体。最后在蒸馏水中进行透析，过滤除菌后于-20℃保存。 1.4 效价测定 采用常规ELISA法及我们以往报道的方法进行［3,7］。包被抗原为30mu;g/ml的蝰蛇毒抗原液，一抗为1000倍稀释的卵黄上清液，二抗为羊抗鸡IgG-HRP（按1:5000稀释），底物为TMB溶液，显色15min后每孔加50mu;l 2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上读取波长为450nm的光密度值。以免疫前