水产品中无色孔雀石绿胶体金免疫层析法检测.doc

水产品中无色孔雀石绿胶体金免疫层析法检测 【关键词】 胶体金;免疫层析;无色孔雀石绿;水产品无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)是孔雀石绿(Malachite green,MG)在生物内的主要代谢产物和存在形式，已被确证具有高毒性、高残留及三致等毒副作用，主要污染水产品，世界各国均立法禁止使用并进行强制检测〔1-2〕。胶体金免疫层析法(GICA)是20世纪80年代初发展起来的一种新型快速免疫检测技术，具有特异性强，操作简便快捷，成本低廉等优点，已在医学检验、毒品监控、食品安全等领域得到广泛应用〔3-5〕。本研究旨在将金标免疫层析法检测技术应用到水产品LMG的检测中，为样品的现场快速测定提供新的方法。 1 材料与方法 1.1 试剂及设备 氯金酸(AR级，上海化学试剂厂);无色孔雀石绿(德国Sigma-Aldrich公司);无色孔雀石绿抗体(江苏省苏微微生物研究有限公司制备);牛血清白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA)，羊抗兔二抗(德国Sigma-Aldrich公司);硝酸纤维膜、玻璃纤维膜(美国Millipore公司);紫外可见分光光度仪(GBCCINTRA10e，澳大利亚GBC公司);磁力搅拌器(RCTbasic，德国IKA公司);冷冻离心机(himac CR22F，日本HITACHI公司);点膜机(美国bio-dot公司);微量移液器(Thermo，美国热电公司);pH计(320型，瑞士梅特勒-托利多公司)。 1.2 GICA试纸条制备 1.2.1 胶体金制备〔6〕 取0.1 g/L氯金酸溶流70 mL加热并搅拌，沸腾后立即加入10 g/L柠檬酸水溶液2.1 mL，搅拌至溶液呈稳定桔红色，继续反应10 min，停止。 1.2.2 胶体金抗探针的制备〔7〕 取30 mL胶体金溶液，用Na2CO3将pH调为9.0，滴加0.72 mL 0.5 g/L的LMG抗体，搅拌5 min。静置30 min后，4 ℃，7 500 r/min高速离心40 min，弃上清，沉淀用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，离心，弃上清，沉淀用0.5 mL含5% BSA的PBS缓冲液溶解，4 ℃保存备用。胶体金粒选择与鉴定参考文献〔8-11〕。 1.2.3 LMG金标试纸条的制备 自制金标试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫4个部分组成。先将LMG抗体配制成浓度12 mg/L，放入玻璃纤维素膜，浸泡后烘干，4 ℃保存备用。在硝酸纤维素膜上用点膜机将LMG-卵清蛋白结合物(LMG-OVA)和羊抗兔IgG喷成2条线，分别为检测线和质控线，再用含1%BSA的PBS溶液封闭后真空干燥。将吸水纸，硝酸纤维膜，玻璃纤维膜，加样纸，依次粘于PVC背衬板上，裁成细条备用，试纸条检测原理同文献〔12〕。 1.3 样品检测 1.3.1 样品处理 取10 g剪碎的水产品于离心管中，加入20 mL乙酸乙酸，充分均质混匀。4 000 r/min离心10 min，取上清于50 ℃水浴氮气吹干。在吹干样品中加入1∶1环己烷-水溶液20 mL，漩涡震荡提取3 min，静置后取环己烷层，再加入0.8 mol/L的HCl溶液0.2 mL，漩涡震荡提取3 min后静置30 min。加入0.8 mL蒸馏水，混匀后于8 000 r/min离心10 min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，再用0.8 mol/L的NaOH调整pH为6.0～8.0，最后用0.01 mol/L PBS缓冲液定容至10 mL待测。 1.3.2 检测与结果判定 取样品提取液100 mu;L，缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上，将试纸条水平放置，5 min后观察结果。如试纸条硝酸纤维素膜上仅1条红色带出现则判定为阳性;如出现2条红色条带则为阴性;若质控线不出现红色条带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。 1.3.3 方法学指标的确定〔13-14〕 (1)最低检出限实验：本试验条检出限：指从目测看得见检测线至完全看不见检测线时的浓度为最低检出限〔15〕。将LMG标准品配置成160，80，40，20，10，5，0 mu;g/L等系列浓度，观察各浓度显色情况，判断最低检出限。(2)重复性实验：配制LMG为0，20，100 mu;g/L标准工作浓度，每个浓度分别用8条试纸条检测，观察各浓度显色情况，根据显色来判断试纸条的重复性。(3)稳定性实验：将试纸条放入37 ℃环境下进行加速破坏性实验，每隔24 h测定1次，(37 ℃下24 h相当于4 ℃于45 d的破坏效果)，检测LMG标准溶液0，20，100 mu;g/L观察试纸条显色情况，折算后确定试纸条保质期。(4)交叉反应实验：将孔雀石绿、结晶紫、氯霉素、副品红、甲基蓝、四环素等标准物质配制12 500，5 000，1 000，