沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用.doc

沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用 【摘要】目的 探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响，阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制。方法 设计并构建pSilencerTM3.0H1GRP78 siRNA重组质粒，脂质体介导转染至SKOV3细胞。RTPCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RTPCR检测MMP2、MMP9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率。结果 RTPCR及Western印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RTPCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP2、MMP9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P0.05)和迁移率均明显降低(P0.05)。结论 ①转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3细胞GRP78基因表达;②抑制GRP78基因表达能降低SKOV3细胞的侵袭力和迁移力，有望为抑制卵巢癌转移基因治疗提供新的靶点。 【关键词】 葡萄糖调节蛋白78;人卵巢癌SKOV3细胞;RNA干扰;侵袭　卵巢癌具有早期容易发生腹腔广泛转移和播散的特性，故侵袭和转移是影响预后的最主要因素之一〔1〕。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在蛋白质的折叠和转运中有重要作用，是促进正常状态下细胞蛋白质成熟、维系细胞机能和生命的重要调节物质〔2〕。已有研究证明GRP78在转移瘤高表达，且GRP78表达水平与淋巴结转移程度密切相关，说明GRP78在肿瘤的侵袭和转移中可能发挥调节作用〔3〕。实验证实下调GRP78的表达可抑制肿瘤细胞体外侵袭力，同时抑制异种移植瘤的体内生长和转移〔4,5〕。目前针对GRP78在肿瘤侵袭作用的研究主要集中在胃癌、肝癌、乳腺癌等方面〔6,7〕，而其在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究构建GRP78 siRNA重组质粒，通过特异性下调卵巢癌细胞(SKOV3)中GRP78的基因表达，探讨其对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞系 SKOV3细胞系购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所。SKOV3细胞培养在37℃、5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规方法培养，0.25%胰酶消化传代。 1.2 方法 1.2.1 试剂 胎牛血清(购自美国Clark公司);RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司);Trizol、Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen公司);逆转录酶、引物合成(购自大连宝生物工程公司);2times;PCR mix(购自北京天根公司);pSilencerTM3.0H1siRNA表达载体(购自美国Amion公司);基因测序(上海生物工程公司);Transwell小室(8 mu;m)、Matrigel(购自美国BD公司);GRP78抗体、二抗(购自美国SantaCruz公司);分析纯试剂(购自北京鼎国生物工程有限公司)。 1.2.2 GRP78特异性siRNA表达质粒构建 siRNA表达载体 选用pSilencerTM3.0H1 siRNA表达载体(Amion公司，美国)。根据Gene Bank人GRP78基因mRNA已知序列(NM 005347.3)，针对编码区设计siRNA模板序列如下：正义3prime;GGA GCG CAU UGA UAC UAG ATT5prime;;反义3prime;UCU AGU AUC AAU GCG CUC CTT5prime;。用限制性内切酶(BamHⅠ、HindⅢ)对pSilencerTM3.0H1GRP78 siRNA重组质粒(简称pSH1SiGRP78)进行双酶切，阳性质粒经上海生物工程技术服务有限公司自动测序仪测序。 1.2.3 转染SKOV3细胞 SKOV3细胞接种于100 mm平皿中，待细胞生长融合率达到80%～90%，按Lipofectamine 2000说明书将质粒转染到SKOV3细胞中：取16 mu;g 质粒溶于800 mu;l RPMI1640培养基中;将40 mu;l Lipofectamine 2000溶于RPMI1640培养基，终体积为800 mu;l;将上述两种液体混匀，室温孵育20 min，形成DNALipofectamine 2000复合物;SKOV3细胞用RPMI1640培养基洗3次，加入DNALipofectamine 2000