信号抑制型三磷酸腺苷电化学发光体传感器研究.docVIP

信号抑制型三磷酸腺苷电化学发光体传感器的研究 　　摘 要：三磷酸腺苷（ATP）是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物，ATP水解时释放的能量高达30.54 kJ/mol，它是动物活动的能量来源，因此构建高特异性、高灵敏检测ATP的抑制型电化学发光适体传感器是一个具有挑战性的课题。本文构建了一种高特异性、高灵敏检测ATP的抑制型电化学发光适体传感器。此传感器检测ATP浓度在1.0×10#8722;10～5.0×10#8722;8 mol/L范围内与电化学发光信号变化成线性关系，相关系数为0.9925，检出限为3.0×10?11 mol/L（S/N=3），并且对AMP、CTP、UTP、GTP、Adesion有很好的选择性。 　　关键词：信号抑制型 三磷酸腺苷 电化学发光 　　 　　电化学发光是将电化学和化学发光结合起来的一门技术，它兼备了两者的优点[1，2]。三磷酸腺苷（ATP）是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物（指水解时释放的能量在20.92 kJ/mol以上的磷酸化合物），ATP水解时释放的能量高达30.54 kJ/mol，它是动物活动的能量来源，因此构建高特异性、高灵敏检测ATP的抑制型电化学发光适体传感器是一个具有挑战性的课题。本课题我们设计了基于目标诱导替换的三磷酸腺苷（ATP）电化学发光适体传感器的研究。如图1所示，当没有加入待测物，标记有钌联吡啶衍生物的ATP适体链能够和捕获探针很好的结合，电化学发光信号很强；当加入ATP后，电化学发光探针解离，电化学发光信号降低，此为信号抑制型电化学发光适体传感器。基于此，我们构建了两种高特异性、高灵敏地检测三磷酸腺苷的基于目标诱导替代的电化学发光适体传感器。 　　 　　图1 基于目标诱导替换电化学发光适体 　　传感器检测ATP响应原理图 　　Fig. 1 Schematic digram of ECL aptamer-based ATP biosensor. 　　一、实验部分 　　1.试剂和仪器 　　ATP、AMP（一磷酸腺苷）、CTP（三磷酸胞苷）、UTP（三磷酸尿苷）、GTP（三磷酸鸟苷）、Adenosine（腺苷）均购于上海生物工程有限公司。其他试剂均为分析纯等级，整个实验过程Millipore公司Milli-Q超纯水制备系统生产的水（18 M#61527; cm）。根据文献合成的ATP适体链用与构建电化学发光适体传感器，购自上海生物工程有限公司并用高效液相色谱法纯化。 　　2.三磷酸腺苷电化学发光探针和传感器的制备 　　首先，在含有5.0×10-3 mol/L 4-氨基苯磺酸的0.10 M KCl溶液中扫描电位为+0.50V~1.40V 以10mV/s 循环（Ag/AgCl 为参比电极）条件下扫描四圈，这样可将4-ABSA共价修饰到PIGE电极上。第二步，将末端带磺酸基的电极（PIGE/4-ABSA），在含有4.0×10-2 mol/L PCl5 的丙酮溶液中活化30分钟，接着用大量的水和乙醇连续清洗以除去物理吸附的物质。第三步，在37℃条件下，将活化的PIGE/4-ABSA 浸入到20μL 适当浓度的捕获探针溶液中6个小时，然后用 PBS 缓冲溶液和水清洗。将制备好的修饰电极贮存于4 ℃的冰箱中待用。 　　3.电化学发光信号的测量 　　电化学发光的测量是在 2.0mL0.10mol/LPrA-0.10 mol/L PBS（pH 7.40）溶液中，以饱和Ag/AgCl电极为参比电极；从起始电位为0 V跃迁到1.35 V来检测ATP的电化学发光值，根据峰值定量。除非另外说明，所有的测量均在室温下操作（~25 ±2 ℃）。 　　二、结果和讨论 　　1.传感器的设计原理 　　在没有ATP时，信号降低型电化学发光适体传感器出现一个强的电化学发光信号（2074 a.u.和1920 a.u.）。ATP浓度分别为5.0×10?10 mol/L和5.0×10?8 mol/L ATP时，目标诱导作用使得3’标记的电化学发光探针从电极上解离，电化学发光信号从803 a.u.降低到152 a.u.。因此，此电化学发光适体传感器可以用于检测ATP是可行的。 　　2.施加电压和结合时间的优化 　　首先我们考察了电化学发光适体传感器与5.0×10-10 mol/L ATP作用前后电化学发光适体传感器积分强度与施加电压的关系，如图2A所示。由图2A可知，电化学发光适体传感器作用ATP后电化学发光强度随着施加电压（1.1-1.35 V）增加而先增大，随后降低，作用后积分强度最大值出现在1.35 V。这可能是由于钌联吡啶衍生物在+1.35 V时能够有更好被氧化的缘故。随后的实验我们选择施压电压为+1.35 V来获得高的灵敏度。我们固定施加电压，考查了传