激活突变shp-2酪氨酸磷酸酶对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制的探讨-effects of activated mutant shp - 2 tyrosine phosphatase on malignant biological behaviors of hepatocellular carcinoma cells and its molecular mechanism.docx

中英文缩写（AbbreviationIndex）简称SDS英文全称sodiumdodecylsulphate中文名称十二烷基硫酸钠SDSSDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ddH2Odi-distilledwater双蒸水EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EBethidiumbromide溴化乙锭,FNFibronectin纤维连接蛋白TBSODTrisbufferedsalineopticaldensity三羟甲基氨基甲烷光密度PMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟ECLenhancedchemiluminescence增强化学发光剂WBWesternblot蛋白印迹法FBSfetalbovineserum胎牛血清PBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液DMSODimethylsulphoxide二甲基亚砜ERKextracellularsignal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶PI3Kphosphatidylinositol-3phosphatekinase磷酸磷脂酰肌醇3激酶AKTproteinkinaseB蛋白激酶BAmpAmpicillin氨苄青霉素激活突变SHP-2酪氨酸磷酸酶对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制的探讨中文摘要背景肝癌是世界上三大引起死亡的癌症之一，大约80%的肝癌患者是由肝炎病毒感染引起的，其中乙肝病毒携带者患肝癌的风险比正常人高5～15倍，大约有四分之一的乙肝病毒慢性感染者会发生肝硬化，每年有3%～8%乙肝病毒导致的肝硬化患者会恶化成肝癌。近年来越来越多的研究表明，SHP-2的激活突变及过度表达可能与实体瘤的发生和转移密切相关，但其在肝癌的发生、发展演化和转移中的作用机制尚未明确。SHP-2是一种蛋白酪氨酸磷酸酶(ProteinTyrosinePhosphatase,PTP)，广泛表达于各种组织和细胞中，主要在各种造血细胞中高表达。SHP-2在N末端含有2个SH2（即Src同源体2）结构域，C末端含有1个PTP催化结构域及2个酪氨酸残基（Tyr542和Tyr580）以及一个富含脯氨酸(Pro)的模体。每个SH2区都具有独立的磷酸酪氨酸结合位点。生理状态下N末端的SH2结构域与PTP结构域特异性结合抑制了SHP-2的催化活性，但在各种生长因子、干扰素以及胰岛素等刺激后，酪氨酸磷酸化的蛋白底物与SHP-2的两个SH2结构域结合，或SHP-2C端两个酪氨酸位点磷酸化结合自身的SH2结构域，暴露出PTP催化结构域，从而使SHP-2蛋白去磷酸化活性得以恢复，发挥酪氨酸磷酸酶活性和接头蛋白的功能。近年来，SHP-2激活突变在血液病方面研究已经取得许多可喜的成绩，另外SHP-2基因在实体瘤发生、发展中的作用越来越引起人们的关注。研究表明在部分肝癌细胞株中也能检测到SHP-2是呈高水平表达的；因此推测SHP-2可能在肝癌的发生发展过程中起到了至关重要的作用。然而目前有关SHP-2与肝癌相关性研究很少有报道，本课题我们将对其进行研究。方法（1）本研究用成功构建的SHP-2真核表达载体，转染肝癌细胞HepG2，筛选并鉴定了稳定表达SHP-2的HepG2细胞株；（2）检测SHP-2激活突变及过表达对HepG2细胞增殖、克隆形成能力、凋亡和迁移侵袭的影响；（3）分析SHP-2对肝癌细胞恶性生物学行为影响的可能作用机制。结果（1）成功的将SHP-2野生型及突变型真核表达载体转染进HepG2细胞，挑取的单克隆细胞，经Westernblot的筛选和鉴定，最终筛选出稳定表达SHP-2的HepG2单克隆细胞株。（2）SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞增殖和周期的影响：MTT结果显示，未转染的HepG2组和空载组细胞增殖速度接近，而突变组和过表达组增殖率明显增加；平板克隆和软琼脂克隆形成实验结果表明突变组及过表达组单克隆细胞不仅数目多于对照组和空载体组，而且体积比对照组和空载体组大；细胞周期检测显示突变组和过表达组S期细胞增殖明显快于对照组和空载组细胞。说明转染SHP-2后增加了细胞的生长能力。（3）SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞粘附能力和凋亡的影响：粘附实验检测结果显示，突变及过表达组细胞粘附率高于对照组和空载体组；凯基Annexin-V/EGFP试剂盒检测细胞凋亡结果发现，突变组及过表达组凋亡细胞均明显低于对照组和空载体组。说明转染SHP-2增加了细胞的粘附和抗凋亡能力。（4）SHP-2激活突变及过表达对肝癌细胞迁移和体外侵袭能力的影响：细胞划痕和Transwell小室检测细胞迁移法发现，激活突变及过表达组细胞迁移率明显高于